基因工程实验报告、小麦GAPDH截短体的重组与表达摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。

通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。

关键字：小麦基因；载体；感受态前言基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。

为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。

它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

它克服了远缘杂交的不亲和障碍。

（一）实验过程1.实验部分流程：2．小麦总RNA提取（Trizol法）2.1 材料小麦幼苗2.2 试剂配制及器具处理① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。

剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。

③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

④Trizol⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

⑥氯仿(最好用新的)。

⑦异丙醇(最好用新的)。

2.3 操作步骤：①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。

②室温放置5min，然后加入200µL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。

③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µL异丙醇，温和颠倒混匀。

室温放置10min，12000rpm 离心10min。

④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。

⑤重复步骤④。

⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。

用30µL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

3. RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 试剂① RNA模板②Olig（dT）18③反转录缓冲液④dNTP⑤ M-MULV反转录酶⑥ RNA抑制剂（RNasin）⑦Premix EX Taq DNA聚合酶⑧ PCR特异引物3.2操作步骤：3.2.1 RNA的反转录采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6µL（需加入RNA约1μg）OligodT primer 1µLH2O（nuclease-free）5µL12µL65℃ 5min，补加下列试剂：5× Reaction buffer 4µLRibolockRNase Inhibitor 1µL10mM dNTP Mix 2µLRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1µL20µL42℃ 60min70℃，5min，﹣20℃保存3.2. 2 PCR 扩增目的基因用表达引物扩增目的基因（25µL 体系）2×PCR Mix 12.5µL 95℃ 1min95℃ 10s 58℃ 20s 72℃ 45s 72℃ 10min 16℃∞cDNA 1µL 引物GA22PDH1-1 1µL 引物GAPDH1-2 1µL H 2O 9.5µL total 25µLPCR 产物经胶回收。

4．核酸琼脂糖电泳分析 4.1 试剂① TAE 缓冲液（50×）：用时需稀释50倍 ② 点样缓冲液Loading buffer （10×）：含0.25%溴酚蓝和40%甘油 ③ 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml 溴乙啶，注意EB 具致癌作用。

④ 琼脂糖 4.2 操作步骤4.2.1 琼脂糖凝胶的制备称1g 琼脂糖加入100ml TAE 缓冲液中加热熔化。

4.2.2 胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。

然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TAE 缓冲液），拔掉梳子。

注意：缓冲液要高出胶面2mm 。

4.2.3 点样每个样品中加入1/10体积Loading buffer （10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。

4.2.4 电泳接通电源，80V 电压电泳40min 左右，当溴酚蓝到达凝胶前沿约2㎝处时停止电泳。

4.2.5 观察及照相将凝胶取出，在EB 溶液中浸泡10min 后，用凝胶成像系统照相。

5.pGEX 4T-1质粒的提取5.1 实验材料含质粒的大肠杆菌 5.2 试剂质粒提取试剂盒(天根生物科技)35cycles5.3操作步骤5.3.1培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于 LB 平板培养基上，37℃培养 24 h，然后从平板上挑取单菌落，接种于 5 mL 液体培养基中，37℃培养 12 h。

5.3.2提取步骤①柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入 500µL 的平衡液 BL，12,000rpm（~13,400×g）离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）②取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心，12,000rpm（~13,400×g）离心 1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

③向留有菌体沉淀的离心管中加入 250µL 溶液 P1（请先检查是否已加入 RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

④向离心管中加入 250µL 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。

⑤向离心管中加入 350µL 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心 10min，此时在离心管底部形成沉淀。

⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心 30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将⑦吸附柱 CP3 放入收集管中。

⑧向吸附柱 CP3 中加入 600µL 漂洗液 PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心 30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。

⑨重复操作步骤 7。

⑩将吸附柱 CP3 放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心 2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

⑪将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100µL 洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000rpm（~13,400×g）离心 2min 将质粒溶液收集到离心管中。

5.3.3琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA6表达载体和目的片段的酶切6.1试剂①BamHⅠ②SalⅠ③BamHⅠ buffer④质粒提取试剂盒6.2操作步骤6.2.1在 LB 液体培养基中接入带pGEX 4T-1 质粒的菌种，在 37℃下 200rpm 摇菌过夜。

参见实验 8 的方法提取质粒。

7载体和外源 DNA 的连接反应7.1试剂①目标 DNA 片段（PCR 扩增产物）②载体（pGEX 4T-1 酶切回收产物）③10×ligation 缓冲液④T4 DNA 连接酶⑤ddH2O7.2操作步骤8感受态细胞的制备及转化8.1实验材料大肠杆菌 Top 10 或 BL21（DE3）PlysS8.2试剂① LB 培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录 2）②氨苄青霉素8.3操作步骤8.3.1感受态的制备①从 LB 平板上挑取单克隆于 5ml LB 培养基中，37℃ 200rpm 摇菌 12～16h。

②将活化过的菌按 1～5％的体积比接种到新的 LB 液体培养基中，37℃ 200rpm 摇菌约 2h，OD 600 约为 0.4。

③取 1.5ml 摇好的菌液于一个1.5ml 的 EP 管中，4℃4000rpm 离心 3min，弃上清。

④加 250µL 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃ 6000rpm 离心 1min 弃上清。

⑤加 200µL 0.1M 的 CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。

置于 4℃存放。

12h 内使用效果最佳。

注意：无菌操作和保持低温。

培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。

如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。

8.3.2转化①将盛有感受态细胞的 EP 管放置于冰上 10min，加入 10µL 连接产物（若加质粒，则只需加 1µL），温和混匀，冰浴 20~30min。

②42℃热激 90S。

冰浴 5~10min。

③加入 800µL LB 液体培养基，37℃培养 45～60min。

4000rpm 离心 2min，弃去800µL 上清液，剩余混匀用来涂板。

④取含有 50～100g/ml Amp 的 LB 平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布 4µL 200mg/ml 的 IPTG 和 40µL 20mm/ml 的 X-Gal），涂板。