实验报告实验项目名称：基因工程综合实验所属课程名称：基因工程原理班级：12生物工程3班学号：201230620312姓名：李杰锋指导老师：徐学锋目录0.摘要 (1)1.前言 (1)2.实验材料和仪器 (2)2.1 实验材料 (2)2.2 实验仪器 (2)3.实验试剂 (2)3.1DNA提取所需试剂 (2)3.2 PCR实验所需试剂 (2)3.3 双酶切实验所需试剂 (2)4.实验步骤 (3)4.1 质粒DNA提取 (3)4.2 聚合酶链式反应（PCR） (3)4.3 质粒DNA的双酶切分析 (4)4.4 琼脂糖凝胶制备 (4)5.实验结果与分析 (5)5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果 (5)5.2 PCR扩增实验结果 (5)5.3质粒DNA的双酶切分析结果 (6)摘要：本实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。

通过本综合实验，进一步理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，也掌握了DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，进而了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA或RNA的地方。

关键词：凝胶电泳限制线内切酶DNA质粒1 前言本次实验对象为含有重组了1kb DNA片段的PET32.a表达质粒。

该表达质粒中长度约6kb。

首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA。

最后通过各种化学抽提纯化质粒DNA，最后得到纯化后的DNA质粒作为之后实验的材料。

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。

混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

PCR是根据DNA双螺旋结构在变性温度下解链为单链DNA，在退火温度下加入反应体系的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在延伸温度下，通过DNA聚合酶的聚合作用，不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，由引物引导合成出与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增的技术。

本次实验我们将以纯化后的质粒DNA作实验材料，在预先设计好引物后用PCR技术扩增目的片段。

利用提取的质粒DNA作目的序列的双酶切实验。

限制性内切酶能在适当温度、pH等条件下识别DNA序列中的特定序列并对识别序列进行有效切割。

利用琼脂糖凝胶电泳，通过电泳结果检验DNA提取纯度、PCR和双酶切实验的效果，并对比各组实验效果了解实验各步骤的各项影响因素核试验操作。

2 实验材料和仪器2.1实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约1000bp DNA片断的PET32.a表达质粒，Amp抗性）2.2 实验仪器高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪、小三角瓶、PCR仪、微量移液器、冰盒、制胶模、电泳仪3 实验试剂3.1 DNA提取所需试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.23.2 PCR实验所需试剂实验一提取的质粒DNA，0.5U/μL的 Taq酶及5 × PCR buffer、1 mmol/L 的dNTP、克隆基因特异引物PF、PR（各1µmol/L），0.2mL的PCR管，TIP头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，10×上样缓冲液，0.5×TBE、marker DNA等。

PCR扩增引物： PF：5`—CTCGGATCCATGGAGCTAGCTACTGCGGG—3`PR：5`—CCGGTCGACTCCATCAATCTTGGAAAGCA—3`3.3双酶切实验所需试剂实验一提取的质粒DNA，BamH I（3 U /μL），HindⅢ（3 U /μL），1.5mL的EP 管，TIP头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，6×上样缓冲液，0.5×TBE等。

4 实验步骤4.1 提取质粒DNA4.1.1 挑LB固体平板菌落于2ml含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。

4.1.2 取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清。

4.1.3 加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡以充分混匀。

4.1.4 加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌。

4.1.5 加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min，12000rpm离心5min；吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min。

4.1.6 移取上清液500μL至一新1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；加入200μL 70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干。

4.1.7 加入20μL RTE（含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA， 37℃放置10min，乃至30min，以充分消化RNA。

4.1.8 取4～5μL质粒DNA溶液于另一干净离心管中，加入8μL TE及2μL上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中。

4.1.9 打开电源开关，调电压为80～100伏进行电泳。

4.1.10 电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。

4.2 聚合酶链式反应4.2.1 PCR反应液配制反应液组分起始浓度反应系终浓度20µL反应体系所需量DNA模板提取的质粒5ng到10ng 取2μL已稀释20×的质粒DNA溶液引物PF 1µmol/L0.2µmol/L 4µL引物PR 1µmol/L0.2µmol/L 4µLdNTP mix 2.5mmol/L 0.25mmol/L 2µL反应buffer 10×1×2µLTaq酶0.5U/µL20µL体系加1U 2µL无菌水HO ——补水至总体积20µL，混匀盖上盖24.2.2 把上述配制的反应液体系放置于PCR仪中，并使PCR仪运行如下PCR反应程序，实现靶DNA的扩增。

94℃ 3min→94℃ 50sec→54℃ 50sec→72℃ 1.5min→72℃ 5min↑ 20循环↑4.2.3 PCR扩增过程中，全班分组按实验一的方法制备1％的琼脂糖凝胶。

4.2.4 PCR结束后取10µL反应产物，加入2µL上样缓冲液，混匀并全部上样于1％琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL marker DNA做标准分子量大小对照。

4.2.5 接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟。

4.2.6 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果。

4.3 质粒DNA的双酶切分析4.3.1 在一1.5mL离心管中配制反应体系为20µL的质粒双酶切反应液：加入成分加入量质粒DNA （<1μg）2-5μL10×Buffer1μLBamH I 1μLHindⅢ1μLO 补水至20μLddH2用移液器tip头轻轻混匀。

4.3.2 37℃恒温条件下酶切反应约1-1.5h。

4.3.3 酶切结束后，往酶切反应管中加入4μL 6×上样缓冲液，轻轻混匀。

4.3.4 取10μL酶切液点样于琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL标准分子量 marker DNA。

4.3.5 接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟。

4.3.6 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果。

4.4 琼脂糖凝胶制备4.4.1 称量0.3g的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中。

4.4.2 加入30mL 0.5×TBE于三角瓶中，称出总重量并记录。

4.4.3在微波炉中充分溶解，称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量。

4.4.4 室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度，并经常摇动防止降温不均匀导致局部凝固现象，此时再加入1.5μL goldview 染料(原则上按照100mL 琼脂糖液加goldview 染料3-5μL )，混匀。

4.4.5 把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固。

4.4.6 拔掉梳子，把凝胶转移到电泳槽中，即可用于点样和电泳检测。

5 实验结果与分析5.1 质粒DNA 提取所得凝胶电泳结果图1 质粒DNA 的电泳图M:DNA marker III ；泳道1-6：不同样品提取质粒上图中有3条相近的条带（第一条最亮），原因是提取的质粒DNA 相对质量相同，但各种因素导致会出现螺旋、线形和开环这三种泳动速度不同的构像。

5.2 PCR 扩增实验结果图2 质粒的PCR 扩增M:DNA marker III ；泳道1-6：PCR 扩增产物4500300020001200800bp M 1 2 3 4 5 6bp M 1 2 3 4 5 64500300020001200800以pF/pR 为引物，使用PCR 克隆技术扩增不同样品的质粒，经凝胶电泳，结果显示扩增片段大小约为1kb ，与预期结果相符（图2）。