实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备
【实验步骤】
1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。

2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。

3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。

4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。

5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。

6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。

7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。

8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。

实验二：目的基因质粒（或218）
和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取
【实验步骤】
一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）
1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。

2、将管放到42C保温90s,冰浴2。

3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。

4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。

5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。

二、质粒的提取
1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。

2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,
4次，弃上清。

3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。

4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。

（不能再剧烈震荡）
5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。

6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。

7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。

8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。

9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。

10 55C烘干至无酒精，加入20 ,所有集成一管后加入1~2 , 37C消化1~2h, -20 C保存。

11电泳分析。

制胶：0.14g琼脂糖，20 1 X缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳子，冷
却凝固待用。

点样：6质粒+1上样缓冲液。

电压：180V,电泳至蓝色带距离点样孔3。

实验三目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化
【实验步骤】
1酶切
酶切体系
试剂小量酶切大量酶切
火菌水5一
质粒1088
I0.51
出0.51
按以上酶切体系加入0.5管中，37C放置3h，电泳回收片段。

（点样：酶切体系100上样缓冲液20。

）
2酶切产物的回收
1）将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管中，称取重量。

2）向胶块中加入3倍体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100，则加入300溶胶液），50-55C水浴放置10,期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有的胶溶液中加10-30 3N醋酸钠（5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响与吸附柱的结合，影响回收效果。

3）将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13, 000离心30-60S, 倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合的
能力较弱。

4）向吸附柱中加入700漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13, 000离心30-60S，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5）向吸附柱中加入500漂洗液，13, 000离心30-60S,倒掉废液。

6）将离心吸附柱放回收集管中，13, 000离心2,尽量出去漂洗液，将吸附柱开盖于室温1-2,彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70 C预热的洗脱液，室温放置2。

13, 000离心2收集溶液。

8）产物-20 C保存。

完毕后电泳检测回收与纯化效果：回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切胶过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法进行回收
与纯化。

实验四目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定
【实验步骤】
1载体与目的基因的连接
1）在一1.5管中加入2酶切后的载体与6目的片段。

2）添加1的10 X以及1的T4连接酶，总体积10。

3）16 C水浴条件下保温过夜连接。

2感受态细胞与连接产物的转化
1）取感受态细胞21 （实验一制备）200,加入6连接产物，轻轻用枪吹打混匀（不可震荡）。

2）冰浴30。

3）热激：42C保温90S，冰浴2。

4）加入800培养基，37 C慢慢复苏30。

5）将复苏菌液4000离心1,先吸去800卩L上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取50卩L细胞悬液直接涂布在含氨苄青霉素（）100、和的选择平板上。

6）将平板正向放置30左右至液体被吸收，倒置平板37C培养16—20h出现菌落，其中白色为重组质粒。

3重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析）
1）将白色单菌落接入3含抗生素（）的液体培养基中，37C振荡培养过夜。

2）按实验二的方法提取质粒，20溶解沉淀。

3）双酶切质粒20体系，方法同上。

4）1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。

（酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的32a质粒条带，一为
目的基因条带。

）
实验五目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的分析
实验I、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
【实验步骤】
1. 分别挑取白斑菌落（重组菌株）、蓝斑菌落（非重组菌株）于5含的液体培养基中，37C,
190振荡培养过夜（注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌）。

2. 分别取过夜培养菌1接种到5含的液体培养基中（蓝，白斑各3管，作好标记），于37 C
摇床培养4h左右，达到1个值。

3. 因为诱导剂的量，诱导条件，诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如下6组设计培养
4. 分别取6支试管按上述表格控制条件，摇瓶培养5h。

5. 取1摇瓶后菌液于离心管，共6支，4C低温离心，12000 , 5，收获菌体，弃上清，取沉淀（菌体可放-20 C存放备用）。

6. 向每支试管沉淀均加入200卩L液，将细胞悬浮。

7. 每管加入200卩L 2 X 。

开水煮沸5，再冰浴2, 4C ,12000 , 5，取上清液做凝胶电泳。

8. 观测结果及分析（实验n）。

实验n 检测表达蛋白
【实验步骤】
①按要求装好胶板
②按比例调好分离胶，混匀后加入两玻璃夹缝中，到上口约2处，并小心在胶面上加入1蒸
馏水，约40，等胶自然凝聚后倾斜倒，出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插入 1.5 的梳子（在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶）。

混匀后加入到分离胶上，并没过梳子，待凝固后小心拨出梳子。

3.样品制备
菌体样品与2 X上样缓冲液|：1 混匀，并在100 C沸水浴中保温3-5 ，取出待用。

4•点样，电泳：开始电泳后，先恒压80V,样品进入分离胶后恒压120V,至电泳带跑到前沿
后停止电泳。

5.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶浸泡于染色液中染色30左右，最后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。