实验二 食用菌母种分离
一、实验目标：
1、掌握组织分离法制备母种的方法。 2、掌握组织分离接种技术。 3、会使用超净工作台和培养箱。
二、实验原理：
组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯培 养菌丝的方法。
是一种无性繁殖，双亲的染色体没有经过重组， 因此组织分离基本上可保持亲本的生物学特 性。
三、仪器设备与材料
接种孢子
用接种环 蘸孢子液或孢子粉
涂布于平板上
七、菌种质量的鉴定
鉴定 项目
形态特征、生理特性、 栽培性状、经济效益等
一般从菌种的纯度、长势、颜色、菌龄、 、
均匀度和出菇快慢等6个方面进行鉴定。
好母种
退化母种
出菇试验
栽培
出菇快 产量高 品质好 抗逆性强
菌种种类 品种名称 菌种级别 代 时 生产厂家 接种日期
10、贴标签
写明菌种名称，接种日期，姓名，学号，专业， 随后放入培养箱中，置适宜温度下培养，待 组织块长出菌丝无污染即为纯种。
培养3~5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状 菌丝，转管扩大即得到菌种。
十、结果
1、记录你制作的母种的生长状态； 2、是否有杂菌污染，如有分析其原因。
械及种菇表面消毒；
（3）0.1%KMnO4：一般用于用具、器皿消毒；
4、菌种培养没备
（1）培养箱 培养少量菌种的恒温电器（20~40℃）
（2）培养室
六、菌种分离的方法
菌种分离：将有价值的子实体的局部组织、孢 子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得 纯培养菌丝的操作称为菌种分离。
必 备
1、组织分离：采用食用菌子实体或菌核、菌索 的任何一部分组织培养成纯菌丝体的方法。
无
0.25%新洁尔灭浸2~3min 无菌纱布吸干表面水分
（2）采收孢子
①整菇 插种法
种菇插在孢子收集器中 使孢子散落于培养皿内的方法
用 前 灭 菌
25℃、24h现孢子粉 取出分离材料 培养皿盖严
②钩悬法 生产上采集木耳、银耳的孢子常采用此法。
25℃、24h现孢子粉 取出分离材料
③孢子印法
取成熟的伞菌或胶质的子实体，经表面消毒，切去菌柄， 菌褶向下，放置于灭过菌的有色纸上，用通气钟罩上，静 置一天，孢子落在纸上，形成孢子印，再从中挑取少量孢 子转入试管培养基上培养。
2、环境、用具严格消毒：
打开紫外灯，30min后关闭杀菌灯。
3、用75%的酒精棉球对手指和菌种试管外壁消 毒。
4、点燃酒精灯。
5、蘑菇体消毒
将子实体菌柄基部切除，置接种箱内，在超净 工作台上以75%的酒精擦拭，进行表面消毒。
6、组织分离：
解剖刀经火焰灭菌，在蘑菇柄中纵切一刀，用 手掰开再用刀片在菇盖与菇柄交界处切黄豆大 小的小方块，放入培养皿中。
无菌检验
注入种管
淹没斜面约1cm
口堵胶塞
用时转管再转管
3、自然基质保藏法 4、菌丝球保藏法： 5、滤纸保藏法 6、真空冷冻干燥保藏法 7、液氮超低温保藏法
（三）保藏注意
用保种培养基 及时保藏（菌丝占斜面2/3） 最好换胶塞 用时活化 严：挑选生长健壮，菌聆年龄适中， 无病虫害，具有本品种优良性状的固体或组 织作为种菇。
7、左手拿试管，用左手的大拇指和其他四指并 排握住，斜面向上，并使试管位于水平位置。
8、右手拿镊子，在火焰上将凡在接种过程中可 能进入试管的部分全部用火烧过。
9、用右手小指和无名指及手掌拔掉胶塞。用火 焰灼烧试管口，灼烧时应不断转动管口。将 烧过的镊子，稍微停留片刻，使之冷却，然 后夹取小块迅速移接到斜面培养基中央，并 塞好塞子。
组织
培养 PDA
特点
简便，易成功 保持原菌种性状 重复多易退化 不适于耳类
次生菌丝
2、木腐菌基内菌丝分离
①把分离用菇木的部分或全部的表面在火焰上轻燎。
②取小刀在火焰上灭菌，对准菇木上菇柄的着生位 置切成两半。
③确定欲分离菌丝在菇木上的位置，再次用火焰灭 菌过的小刀，在欲分离部位刻划数个井字。
④用火焰灭过菌的接种钩，钩取一小块木屑移接于 斜面培养基。
用于生产
八、菌种保藏 （一）保藏目的及原理 ➢目的 不死亡 不生长
不污染
使菌种 不降低或不丧失其优良性
➢原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
缺营养
低温
不利 条件
无氧
干燥
（二）常用保藏法
1、斜面低温法
2、矿油保藏法
矿油 处理
灭菌：152kpa、30min 去水：40~50℃烘至无色透明
PDA斜面培养基、解剖刀、镊子、超净工作 台、无菌室、酒精灯、培养箱。
香菇。
四、制种程序
五、菌种生产常用的设备和方法
1、接种工具
环
枪
针
匙 接种 耙
钩
镊
铲
液体菌种接种枪
固 体 菌 种 接 种 枪
2、接种设备 （1）接种室 （2）接种箱 （3）超净工作台
3、常用的消毒设备： （1）70%酒精：一般用于手、种菇表面消毒； （2）0.1%升汞：常用于玻璃器皿、非金属器
⑤接种后将试管置于25~27℃下培养，促使其恢复。 近风干的种木内菌丝常处于休眠状态。
3、孢子分离 孢子分离主要是指利用子实体上产生的成熟有 性孢子分离培养获得纯菌种的方法。分为多孢 分离与单孢分离两种。
孢子 特点
菌龄小 生命力强 变异率高
（1）种菇 消毒
菌柄去2/3 苞被 有：75%酒精棉球擦