α-2-巨球细胞
S-23 骨髓瘤蛋白 3-氧代类固醇异构酶 胰蛋白酶
Cu2+
二硝基酚 雌甾二醇l 对氨基苯咪
PEG/dextran
PEG/dextran PEG/ dextran PEG/dextran
6.1.2 亲和配基高聚物的合成
亲和双水相中亲和配基可固定在上相高聚物或下 相高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体 系中。 一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通 过化学方法结合在PEG上。
二次作用亲和沉淀
制备亲和沉淀介质:利用在物理场如pH、离子强度、 温度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶 性聚合物为载体固定亲和配基。 亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质 与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。 沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。
特异性结合 目标分子
形成 亲和沉淀
目标分子 解离
亲和沉淀原理图
亲和沉淀的优点
溶液中进行，无扩散传质阻力和结合时的空间位阻， 亲和结合速度快，结合充分； 亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物 的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是 极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害 的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离 出来，有利于提高产品的质量和收率
目标蛋白质的结合位点不被配基－聚合物饱和时
KC K P 1 (CL kd )1
N
1 (CL
kd ) 2
N
6.1.4 亲和分配的应用
乳酸脱氢酶（LHD）的亲和分配
6.1.4 亲和分配的应用
葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯化
6.1.4 亲和分配的应用
葡萄糖-6-磷酸化脱氢次作用亲和沉淀 (primary-effect precipitation) 二次作用亲和沉淀 (secondary-effect precipitation)
一次作用亲和沉淀
水溶性化合物分子偶联有两个或两个以上的亲和配基， 即双配基(bis-ligand)和多配基(polyligand) 通过与多价蛋白质 (multivalent protein) 支联，在适 当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。 一次作用亲和沉淀作用机理与抗原－抗体的沉淀作用相 似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率 最高。
第六章
6.1 6.2 6.3 6.4 6.5
亲和分离技术
亲和萃取 亲和沉淀 亲和膜技术 分子印迹分离技术 亲和反胶团萃取技术
6.1 亲和萃取
亲和萃取简介
亲和配基高聚物的合成
亲和分配的影响因素和亲和模型 亲和分配的应用
6.1.1 亲和萃取简介
萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离 技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。 亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分 离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。
主要包括以下两种:
PEG 的活化 亲和配基直接反应
6.1.3 亲和分配的影响因素和亲和模型
影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如 PEG浓度，还有: 配基浓度 配基载体 染料配基 pH: 增加，效率降低 温度: 升高，效率降低 盐浓度
亲和分配的影响因素和亲和模型
盐对分配系数的影响 盐的种类
88
81 89 33 21 —— —— 1 ——
临苯二甲酸钾
NaClO4
——
——
48
42
——
——
亲和分配的影响因素和亲和模型
体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时
亲和分配的影响因素和亲和模型
整个过程的自由能变可以列成如下算式
ΔG5＝ΔG1＋ΔG2＋ΔG3＋ΔG1
G1 RT ln(kd )1
G4 RT ln(k d ) 2
磷酸钠（添加）
添加盐时的△log K占不添加盐时的百分数（％） 25mM 100 63mM 103 250mM ——
甲酸钠，pH7
醋酸钠，pH7 丙酸钠，pH7 Na2SO4 KCl Li2SO4 Tris，pH7 KI NaSCN
——
105 —— 98 104 —— —— 97 ——
——
97 —— 85 80 77 76 69 67
亲和萃取简介
常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质 分离蛋白
白蛋白 碱性磷酸化酶 共脂肪酶（Colipase） 脱氢酶，激酶
亲和配基
脂肪酸 Procion red HE-3G 卵磷脂Lecithin 活性染料
体系 PEG/dextran PEG/dextran, PEG/ 盐 PEG/dextran PEG/dextran, PEG/ 盐
G2 RT ln K L
G3 RT ln K p
G5 RT ln K c
亲和分配的影响因素和亲和模型
推导得
K c (k d ) 2 K L (k d )1 K P
有N个结合位点的蛋白质而言
KC (kd ) 2 K L (kd )1 K P
N
log K max log(K C K P ) N log K L
一次作用亲和沉淀
一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别 是4价以上的蛋白质 要求配基与目标分子的亲和结合常数较高 沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分 离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用 上存在较大难度。 另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配 基自交联(ligandself-assoliation)的现象，成为交 联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所 以人们更多是采用二次作用亲和沉淀。
6.2 亲和沉淀分离技术
亲和沉淀的原理
亲和沉淀聚合物和亲和配基
亲和沉淀可逆性聚合物 亲和沉淀亲和配基 亲和沉淀的展望
6.2.1 亲和沉淀的原理
亲和沉淀(Affinity precipitation)是将生物专一性 识别与沉淀分离相结合的纯化技术。 亲和沉淀的机理：
配体的连接
加到含有目标 分子得溶液中