（二）微量凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml → 10 ml 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L → 0.01mol/L 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置
微量凯氏定氮法装置 （三）自动凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、特点
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外 线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动 数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
苏氨酸* 半胱氨酸
HO
NH2 CH2 CHCOOH
酪氨酸 天门冬酰胺
色氨酸* 丝氨酸
tryptophan
NH2 NH2 COCH 2 CHCOOH
NH2 H2NCOCH 2CH2 CHCOOH
H
NH2 HO CH2 CHCOOH
serine
谷酰胺
glutamine
1
2016-12-13
-aa structure

<5> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收， 再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用 甲基红指示剂。

结果计算
蛋白质含量= C×（V1-V2）×M m×1000
注意： F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为 6.25 ；纯乳 与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生 为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋 白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸 麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
全自动凯氏定氮仪（吸收、蒸馏、滴定）
6
2016-12-13
二、分光光度法
原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解， 分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应 生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡 啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与 标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋 白质含量。
9.2


蛋白质的测定
显色反应

定性分析
氨基黑法 溴酚蓝法 考马斯亮蓝法 酸性品红法 氨基萘酚磺酸法 过碘酸-Schiff 氏试剂显色法 甲苯胺蓝法 阿尔新蓝法 适用脂蛋白 苏丹黑法 油红-O法
适用糖蛋白

3
2016-12-13
蛋白质的定量测定
一些蛋白质的含氮量一般为 15%~ 17.6%
NH2 HOOC CH2 CHCOOH
Cn name 天门冬氨酸
acidic
En name Aspartic acid Glutamic acid lysine arginine histidine
物理特性

NH2 HOOC CH2CH2 CHCOOH
谷氨酸
所有纯净的 -AA 是无色晶体 , 有很高的熔点 (200~300 ℃) 有旋光度，除了甘氨酸 不溶于石油和苯等，但溶于水
④ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生 大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时 应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛 醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热 源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷 却，加入30％过氧化氢 2～3 m1 后再继续加热消 化。
⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g， 可按每克 试样5 m1的比例增加硫酸用量。 ⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的品。如 含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸 等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完 全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。 ⑧ 蒸馏装置不能漏气。
说明及注意事项
①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ×F×100(g/100g) ②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附 在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情 况下消化不完全而造成氮损失。 ③消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用 冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进 其消化完全。
H OH
RCHC O2N+H3
H OH
+
R + NH3 CH COOH
阴离子，在高 pH时
在等电点时是偶极离子
阳离子，在低 pH时
注意: 氨基酸和蛋白质都有酸性和碱性特性，它们都是在低pH 值时带正电荷，在高pH值时带负电荷
氨基酸的等电点(pI)
阳极 + + + + + + + + + 阴极
2. 蛋白质概况
5
2016-12-13
⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢 氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。 氢氧化铜在70～90℃时发黑。 ⑩硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的 吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中 使用。 ⑾蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗 管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸 收液倒吸。
-aa structure
Cn name
En name threonine cystine tyrosine asparagine
NH2 CH3SCH2CH2 CHCOOH CH2 NH CH2 CH2 CHCOOH NH2 CH2 CHCOOH
NH2 CH2 CHCOOH
N
HO NH2 CH3CH CHCOOH NH2 HS CH2 CHCOOH
NH2 CH2COOH NH2 CH3 CHCOOH
CH3 NH2 CH3 CH CHCOOH
CH3 NH2 CH3 CH CH2 CHCOOH
CH3 NH2 CH3 CH2 CH CHCOOH
-aa structure
Cn name 蛋氨酸* 脯氨酸 苯丙氨酸*
En name methionine proline phenylalanine
2
2016-12-13
蛋白质中N的转换因子
食品 蛋或肉 乳制品 小麦 其他谷物及油料种子 杏仁 坚果 其他种子和椰子 转换因子 6.25 6.38 5.70 6.25 5.18 5.46 5.30
蛋白质的主要特性
1. 作为氨基酸的聚合物，蛋白质有酸性和碱性两种性 质， 两性离子 & 等电点& 电泳 2. 大多数蛋白质是水溶性的，不能透过透析膜 3. 变性：加热，酸，碱，盐和洗涤剂都会使蛋白质的 溶解性和功能特性改变 可逆的/ 不可逆的变性 4.在280nm的紫外吸收，因存在三种带有芳香基团的氨 基酸残基：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸
NH2 H2NCH2CH2CH2CH2 CHCOOH
NH2 NH H2N C NH CH2CH2CH2 CHCOOH
赖氨酸* 精氨酸 组氨酸
=
N N H
NH2 CH2 CHCOOH
basic
8
化学特性

氨基酸是两性电解质
RCHC O2H
NaOH
有两性 -COOH, -NH2
NH2
+
HCL
R NH2 CH COO
2. 中和&蒸馏：加碱蒸馏，使氨蒸出
2NaOH +（NH4）2SO4
→ 2NH3↑+Na2SO4 + 2H2O
2016-12-13 22
凯氏定氮法的装置
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯 硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高至 400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高 沸点，但效果不如硫酸钾。 <2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终 点指示剂，以及蒸馏时碱性指示剂。还可以加 氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧 化钛。 <3> 加氧化剂 物氧化速度。 如双氧水、次氯酸钾等加速有机
→ （NH4）2B4O7 + 5H2O
4.用强酸滴定 : 盐酸溶液 (NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl → 2NH4Cl + 4H3BO3 5. 计算 ：（N: HCl = 1:1)
2NH2（CH2）2COOH + 13H2SO4
加热
（NH4）2SO4 + 6CO2 +
12SO2 + 16H2O一定要用浓硫酸（98%）
2016-12-13
主要内容 第9章 蛋白质和氨基酸的测定
1. 概述

蛋白质和氨基酸概况 定性测定 定量测定 定性测定 定量测定
2. 蛋白质的测定

3. 氨基酸的测定

9.1 概述
1.氨基酸概况
氨基酸(AA) : 氨化了的羧酸(R-COOH)
蛋白质中常见的20种 -AA
-aa structu亮氨酸* En name glycine alanine valine leucine isoleucine
3.方法的优势与劣势

四、双缩脲法
1.原理：脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至
150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3
双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双 缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相似。在 同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白 质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。 （540nm） 注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化。
测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价 值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配 方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。