组胺对离体豚鼠回肠的作用及EC 50、pD 2测定[目的] 学习组胺对离体豚鼠回肠平滑肌H 1受体量－效曲线的测定，掌握pD 2的计算方法。

(EC 50：半效能浓度或半最大效应浓度，是指引起一半最大效应的浓度)[原理] 药理学的一个经典实验，实验条件要求不高（动物种类、个体差异甚至操作不够准确，对pD 2值的影响都不大）而且操作简单。

pD 2称为“亲和力指数”，为完全激动药引起50%最大效应所需的克分子（摩尔）浓度的负对数值，表示作用于受体的药物与受体亲和力的大小。

pD 2中的2指激动药浓度乘2倍才能达到最大效应，pD 2不必用摩尔单位，数值大小与亲和力成正比，pD 2越大，表示亲和力越大。

受体与配体结合后，通过第二信使作用，触发特定的药理效应。

药物就是一种外源性配体，根据效应不同，可分为激动药、拮抗药。

今天我们应用的组胺是一种完全激动药。

DK DE E D +=αm a x ，α＝1、maxE DK D E D ⨯+=。

(α表示内在活性，通常0≤α≤1,完全激动药α＝1；)我们将不同浓度的药物与H 1－R 结合后产生的效应一一对应，即可得到双曲线。

由定义知：21m ax =E E ，K D ＝D ，找到Emax （100％），反过来找到50％时的药物浓度（C ）即可。

根据药物浓度可知：D 值相差很大，绘制曲线时有一定难度，数值误差大，因此需引入logD ，这样就可以容纳大范围剂量数，而且还可以鉴别竞争性拮抗作用，可得到S 型曲线，再由50％求对应的logK D 及pD 2=-logK D 。

pD 2∝1/K D ，注意K D 与pD 2不同，EC 50＝K D 而pD 2=-logK D 。

由于S 曲线实际上只有一个最高点得以利用，这样的数据显然缺乏可信度，为了使数据更精确，引入直线回归方程:即:][111][][][][max max max maxD E K E E D K D E E D K D E E D D D ⨯+=⇒+=⇒+= 令max1E a =， m axE K b D =，E y 1=，][1D x =，可得：y=bx+a ，K D ＝b/a 。

（a 是截距、b 是斜率）它所描绘的是一条直线，所有的点都均匀分布于直线，这样的量效关系有较高的可信度，经过统计处理后，此实验数据比较准确，而且对数据的偏离也较敏感，由这样的数据所描绘出的直线可以比较准确的反应受体动力学变化的根本现象和规律，而且所有数据点都可得以利用。

其中涉及相关与回归,这是从不同角度对同一问题的分析，所以关系很密切。

在分析问题时，两种方法一般要结合运用，主要在利用相关系数判断成对变量之间的联系程度，保证回归分析的可靠性，正相关系数γ，γ越趋向于1，说明所得到的点越靠近直线；这里我们可认为γ＝1，则所有点均在一直线上（对于偏离大的点，可舍去）。

[材料]器材：超级恒温仪｛恒温平滑肌槽实验装置一套（麦氏浴槽、恒温装置、万能支架、充气球胆、通气钩、双凹夹、螺旋夹各一个），｝生物信号采集系统，张力换能器，计算器，lml、0.25ml注射器及微量注射器各一支，针头2个，培养皿1个，50ml烧杯2个，普通剪刀、组织剪、眼科剪、眼科镊各一把，止血钳三把，丝线若干。

（装置缺点：液体易从通氧管流出；功率大1500W，要防电。

）药品：磷酸组胺（浓度：3×10-7mol/L、3×10-6 mol/L，3×10-5 mol/L ，3×10-4 mol/L ，3×10-3 mol/L ）；台氏液。

动物：豚鼠（对组胺比较敏感）。

[方法]1.制备豚鼠回肠段2cm/段（回盲交界处最好）。

超级恒温仪的浴槽中加30ml台氏液（水温自动保持在37±0.5℃），通入氧气（95%的氧和5%的二氧化碳最好；调节气泡大小，以不影响肠管收缩为宜）。

然后取上述备用回肠，两端用挂钩挂住，一端系在通气钩上，放入浴槽，另一端挂在换能器上。

2.打开计算机，进入生物信号处理系统，选择“实验项目”中的“消化道平滑肌的生理特性”模块或“张力”模块，调节适当的实验参数，开始实验。

3.观察项目：1）先使回肠在浴槽内稳定约10分钟，描记一段基线，待基线稳定后，再在浴槽内滴加药液。

2）依次加入不同量的磷酸组胺：①3×10-7 mol/L 0.1ml, ②3×10-7 mol/L 0.2ml，③3×10-6 mol/L 0.07ml, ④3×10-6 mol/L 0.2ml，⑤3×10-5 mol/L 0.07ml, ⑥3×10-5 mol/L 0.2ml，⑦3×10-4 mol/L 0.07ml, ⑧3×10-4 mol/L 0.2ml,⑨3×10-3 mol/L 0.07ml, ⑩3×10-3 mol/L 0.2ml……,每次加药后，仔细观察，当肠段收缩曲线到顶点开始出现下降支后再加下一个剂量，直到收缩达到最大效应。

3）在坐标纸上绘制E／E max—log（D）和1／E—1／D两条曲线，同时填写下表：加药次数[D] LOG[D] 1/D(x) E(g) 1/E(y) E/E max(100%)1 10-9 －9 109 测得值－初张力y 1 Y 1 2 3×10-9 -8.523 1／3×109y 2 Y 2 3 10-8 -8 108 y 3 Y 3 4 3×10-8 -7.523 1／3×108y 4 Y 4 5 10-7 -7 107 y 5 Y 5 6 3×10-7 -6.523 1／3×107y 6 Y 6 7 10-6 -6 106 … y 7 Y 7 8 3×10-6 -5.523 1／3×106E maxy 8 Y 8 9 10-5 -5 105 y 9 Y 9 103×10-5-4.5231／3×105y 10Y 10按Scott 比值法计算：a bx E K X E Y +=+=maxmax1[结果]bE 1max =21050PD EC baK -===pD 2 = -logK = -log(EC 50)将结果记录如下表，并回归分析b/a=K D pD 2 = -logK D →pD 2=8.5～8.7[结果分析]1. K D 是受体动力学中重要参数之一，其意义为： （1）K D 是平衡时的解离常数；（2）50%受体与药物结合时 K D =（D ）。

K D 为引起最大效应一半时的药物浓度。

（3）K D 表示D 与R 的亲和力，单位为摩尔。

1/D1/E如果用K D值表示药物与受体的亲和力则成反比，亲和力越大，结合受体越多，K D值越小，同时这一浓度又用摩尔为单位很不方便，如某药浓度为10-5mol/L与50%受体结合，另一药物浓度为10-7mol/L 可与50%受体结合，后者与受体亲和力强，但K D值小，如果用K D 负对数pD2表示就比较方便。

2.由所绘曲线图根据定义所得pD2值与经统计计算所得pD2值比较，体会统计学计算结果的精确性。

比较计算值与理论值并分析误差原因。

可从以下几点分析：①是否给予一定的前负荷；②是否试验时间过长，肠管活性下降；③肠管本身蠕动对数据的影响；④描记图像时间长短及给药时机是否合适；⑤药物浓度及给药量是否准确；⑥数据处理时，偏差大的点是否都已舍去。

[注意事项]1．制备回肠标本及标本连接时，操作要轻柔，切勿用力牵拉。

标本制好后，要放在盛有台氏液的平皿中保存，不得在空气中暴露过久，以免影响标本反应性。

2．实验前后应将平滑肌浴槽彻底清洗，以免残留药影响实验结果。

3.注意给肠管一个初张力或前负荷（1.5g～2.0g）。

3.注药前要清洗注射器，注药时针头不要触及细线，药液不能贴在壁上。

4.台氏液、组胺必须新鲜配制。

[附注]1. 竞争性拮抗药的作用强度常用拮抗参数pA 2表示，P 为负对数，A 为拮抗药浓度，pA 2中的2是激动药浓度乘2倍才能达到原先效应。

PA 2是在实验中加入一定量的拮抗药，能使激动药浓度增加一倍而效应仍保留在原水平，这时激动药的摩尔浓度的负对数即为PA2。

PA2的意义：1）PA 2值越大，表示拮抗药与相应受体亲和力越大，对拮抗药的拮抗作用越大。

2）PA 2值是分析药物与受体作用的有力工具。

如果两个激动药作用同一受体，则它们可被同一竞争性拮抗药拮抗。

并且有相同的PA 2，反之，同一阻断药对这两个激动药的 PA2值不同。

可推测这两个激动药作用于不同受体，这是研究受体分型的手段之一。

2. H 1受体兴奋效应：H 1受体被激动后通过G 蛋白激活磷脂酶C 产生三磷酸肌醇（IP 3）与二酰基甘油（DG ）导致细胞内Ga 2+增加，蛋白激酶活化，使胃、肠、气管、支气管平滑肌收缩，同时释放血管内皮舒张因子(EDRF)及PGI 2使小血管扩张通透性增加。

从而导致一系列的临床症状发生。

主要表现为以下几点：1)扩张血管：使小动脉、小静脉、毛细血管扩张。

2)兴奋平滑肌：使支气管平滑肌收缩、痉挛；使胃肠道平滑肌痉挛。

3)增加鼻和支气管粘膜分泌粘液：引起呼吸系统症状。

4)刺激感觉神经末梢：引起局部痛、痒。

3.（参考孙瑞元《定量药理学》）根据clark 的受体占领学说：(质量作用定律)E DR R D K K →−−←−→−+][][][21（R 表示游离受体；DR 表示结合受体；［］表示摩尔浓度） K 1：结合速率常数。

K 2：解离速率常数。

12K K K =K 为平衡解离常数 （2） 21/K K K =K ＇为平衡结合常数 （3） 则K 1[D][R]=K 2[DR] （4） 移项][][]][[12DR K DR K K R D ==（5）因为［R T ］＝［R ］＋［DR ］ （6） 所以［R ］＝［R T ］－［DR ］ （7） （7）式代入（5）式得 ［D ］（［R T ］－［DR ］）=K ［DR ］ （8）整理得：][][][][D K D R DR T +=（9）另外][][max T R EDR E a == （10）则][][maxT R DR E E = （11）（9）式代入（11）式得：][][maxD K DE E +=（12） 如以药物浓度［D ］为横坐标，药物强度为纵坐标，可绘出双曲线型量效曲线。

如将横轴改为对数剂量（log ［D ］），则量效曲线可以转化为对称的S 型曲线。

这种曲线为量反应的量一效曲线。

（D 代表药物；R 代表受体；DR 代表药物受体复合物；E 代表效应；R T 代表受体总数）量效曲线不便进行回归分析，通常予以直线化（包括Lineweaver-Burk 双倒数法、Scatchard 比值法、Hill 对数法、Scott 比值法），借此可由实测的药物浓度[D ］及药效强度 E 来推算K 及Emax 。