酶联免疫吸附试验技术（Enzymelinked Immunosorbent Assay，
ELISA）（定量、定性实验）
❖ ELISA是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的 基础上发展起来的一种免疫测定技术，既可以定性也可以定 量。主要过程包括将已知抗原(抗体)吸附在固相载体即聚苯 乙烯微量滴定板上称为包被，也就是第一次课用绵羊红细胞 抗原包被酶标板。这样绵羊红细胞抗原就会吸附在反应孔内 壁。通过洗涤，可以将不牢固的抗原洗脱。然后用封闭液 （5% BSA/PBS 溶液）将空余的位点占据，以避免后续抗 体非特异性吸附。洗涤后加待测抗体(抗原), 再加相应酶标 记抗体，形成已知抗原--待测抗体--酶标二抗的复合物，再 与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收 计算待测抗体(抗原)的量。洗涤的重要性：抗原,抗体的反应 在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加 入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而 保证试验结果的特异性与稳定性。
ELISA优点
敏感性高：可达ng水平
特异性强：将抗原,抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化 作用原理有机地结合起来,可敏感地检测体液中微量的特异 性抗体或抗原.。
重复性好：由于其试剂稳定,易保存,操作简便,结果判断较客 观等因素,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域.
ELISA原理
（1） 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载 体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性 部分相互吸附,并保持其免疫学活性; （2） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成 酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和 酶学活性; （3） 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根 据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应 的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗 原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显 色的程度显示试验结果.
免疫酶组化染色法
❖ 直接法：用已知酶标记抗体与组织细胞内相应抗 原反应，形成酶标抗体-抗原复合物，加酶使底物 显色。此法具有操作简便，特异性强的特点，但 一种酶标抗体只能用于检测一种特异性抗原。
❖ 间接法则是在酶标记抗体与组织细胞内抗原之间 增加抗体反应层次，最后行成抗原-抗体-酶标抗抗 体复合物，再通过酶底物显色。对于来源于同一 种属动物不同种类的第一抗体，使用一种酶标抗 抗体就能完成对不同特异性抗原的检测。
❖ 4双重免疫荧光染色：即可在同一标本上定位定性 检测两种抗原。如A抗原的抗体用荧光素罗丹明标 记，呈橘红色，而B抗原的抗体用异硫氰酸荧光酶标技术
❖ 将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相 结合而建立的一种检测术。酶免疫技术按照 抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在 于液相样品中分为酶免疫组织化学技术和酶 免疫测定技术。
常用ELISA方法
3 双抗体夹心法：检测抗原
A:将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表 面；
；
B:加待检抗原，形成抗原-抗体复合物； C:加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗
原抗体复合物； D:加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体)； E:加底物。底物的降解量＝抗原量。
常用ELISA方法
4 加完后统一放入37度温箱1h(大于1h)。
加入底物-酶促反应-反应终止
❖ 1 弃液 ❖ 2 用PBS洗板7次，200μl/每孔，每次一分钟
以上，水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每 次洗完用滤纸拍板，拍干。
❖ 3 于8个ELISA孔中分别加入底物100μl/每孔 。
❖ 4 加完后，室温避光反应10min。 ❖ 5 反应10min后，于8个ELISA孔中分别加入
方法
❖ 1、直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记 上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻 片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜 下直接观察，作出判断。该方法评价：简单易行、特异性高、快 速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检 测。但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有 时不理想，目前较少作为更多方面的检测。
方法
❖ 3补体法：是间接法的改良。它是采用特异性抗体 同新鲜补体混合后再与切片上的抗原反应，补体就 结合在抗原-抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体 与补体结合，形成抗原-抗体-补体-抗补体荧光抗体 复合物。这种方法不仅具有间接法的敏感性，而且 荧光抗体不受免疫血清的动物种属限制，一种荧光 抗体就能检测所有的抗原抗体系统；缺点是较间接 法更容易出现非特异性染色，且补体不稳定，每次 均要采取新鲜血清，操作上比较麻烦。
应用
定性、定量检测抗原和抗体水平 ❖ 间接法ELISA：检测Ab ❖ 双抗体夹心法ELISA：检测Ag ❖ 竞争法ELISA：检测Ag
注意事项
❖ 封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去 除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。
❖ 加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。 ❖ 加不同样品时更换枪头 ❖ 每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分
❖
↓
❖ 加封闭液，每孔200μl，37℃，30min （封闭）
❖
↓
❖ 弃去孔中液体，用PBS洗板3次 ，排干后4度保存
包被和封闭ELISA板（复习）
包被和封闭是ELISA前两个步骤，第一次课已经完成。
包被就是将已知抗原或抗体非特异性，物理性吸附 于固相载体表面并保持其免疫学活性。 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从 而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。 洗涤：不论是包被还是封闭后，我们都用PBST洗 液洗涤三次，目的是去除游离的未结合的物质，从 而保证试验结果的特异性及稳定性。
基本类型
❖ 放射性核素标记技术 ❖ 免疫荧光技术 ❖ 免疫酶技术
1.免疫荧光技术
❖ 即免疫荧光细胞组织化学技术，是根据抗原抗 体反应的原理，采用荧光素标记的已知抗体作为探 针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原，形成的 抗原-抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下， 发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体） 的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算 抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量 测定的目的。分为直接法、间接法、补体法、双重 免疫荧光染色。
❖ 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它 生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。
常用免疫胶体金技术
❖ （1）免疫胶体金光镜染色法 ❖ （2）免疫胶体金电镜染色法 ❖ （3）胶体金免疫层析法
❖胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体
以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗 体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检 样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛 细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标 记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或 抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物 又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检 测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法 现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。 如检测早早孕
3.放射免疫分析
❖ 是把放射性核素测定和抗原、抗体间的免疫 化学反应两种方法结合起来所形成的一种超 微量物质的测定方法。将抗原抗体反应的特 异性与同位素测定技术的敏感性相结合的一 项新技术，具有特异性强、目前为止灵敏度 最高、准确性和精密度好等优点。而且操作 简便、易于标准化，其灵敏度较高，可达109-10-12g水平,是其他分析方法所无法比拟的。
ELISA步骤 包被
↓ 封闭
↓ 加入待测样本
↓ 加入酶标二抗
↓ 加入底物
↓ 加入终止液，终止反应
加入酶（HRP）标记二抗
1 弃液 2 用PBS洗板3次，200μl/每孔，每次一分钟以
上，水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每次 洗完用滤纸拍板，拍干。
3 于8个ELISA孔中加入酶（HRP)标记二抗， 100μl/每孔。
❖
抗体水平（ELISA后续步骤）
❖ 成绩
课堂表现及出勤情况，占5分 实验报告，占10分 期末考试，占10分
复习第一次课操作
❖ SRBC冻融稀释（得到比例适当的抗原，非完整的红细胞）
❖
↓
❖ 每孔加包被液（碳酸盐缓冲液，含抗原）100μl, 37℃ 1h （包被）
❖
↓
❖ 弃去孔中液体，用PBS洗板3次，每次均拍板
❖ 2、间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原 结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形 成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情 况来确定所检测的抗原。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合 物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。 目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于 多种第一抗体的标记显示。
阳性 阳性 阴性 阴性 待测一 待测一 待测二 待测二
1 待测一 本组待测血清样本1:20稀释， 待测二 邻组待测血清样本1:20稀释。
2 1:20稀释 50μl待测血清+950μl PBS 3 每孔加对应液体（注意混匀）100μl，阳性孔和阴 性孔分别加入100μl的阳性、阴性对照液。加不同液 体注意更换枪头，不要串孔。并做好标记 5 统一放入37度孵箱1h（大于1h)
❖ 本次ELISA采用的是间接法检测抗体，定性检 测。
免疫胶体金技术
❖ 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种 新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4 ）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等 作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电 作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体 金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电 荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合 ，所以不影响蛋白质的生物特性。
第四次试验 ELISA法血清抗体检测 免疫胶体金法检测早早孕
免疫学教研室