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问题与讨论：
１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作 用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应 体系出现的现象及其成因。
２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现 的现象及其成因。
3. 沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇及在高 盐、低温条件下进行？
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个人观点供参考，欢迎讨论！
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☆原理示意图 返回目录 返回原理
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——三个基本步骤：
细菌的生长和质粒的扩增 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化
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实验试剂
ＬＢ培养基：
胰化蛋白胨 10g
酵母提取物 5g 定容
1000ml pH
7.5
NaCl
10g
ＳＴＥ：
0.1M
NaCl
10mM
Tris HCl(pH8.0)
２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒， 弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰 上放置5分钟。
４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒５次以混匀内容 物，冰上放置5分钟。
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碱变性法基本原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌 染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状 态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和 蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上 清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。 ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的
Eppendorf管中。
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(７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。)
８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。 ９． １２０００g ,4 ℃离心５分钟。 １０．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠
分子生物学基本技术（一）质粒的提取(源自法)三峡大学生物化学教研室
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实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。
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一．实验背景
质粒是染色体外的DNA分子，大小可为 1kb到200kb。
大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。
1mM
EDTA
ＡｍＰ 50mg/ml
溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制）
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试剂
溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA
溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS
溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml
酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA
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实验仪器
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
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Insert
EcoR1 1.9kb
Xho1
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三．实验方法
１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含 AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度。
倒数次，１２000g 于4 ℃离心２分钟。 １１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 １２．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）
溶解DNA。
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四．结果分析
１．质粒DNA OD260,OD280的值，由此 计算质粒DNA得率和ＤＮＡ纯度。
２．记录电泳结果并说明结果内容。
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质粒的应用
大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒
害致死的基因。
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细 菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运 载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。
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质粒提取的思路
质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质：
蛋白 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA
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分离质粒DNA方法
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、
碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切, 连接与转化。
其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
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质粒特点
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞 一些表型，是比病毒更简单的原始生命。
质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到 雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.
１９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
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结构的三大要素： • 多克隆位点 • 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位 种类： • 质粒 • 噬菌体 • 酵母人工染色体（YAC） • 反转录病毒载体 • 表达载体等
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质粒类型
质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒
1.松弛型质粒
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白， 完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白 质合成受抑制，质粒的复制依然进行。
2.严紧型质粒
严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的 拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。