第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。

1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。

B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。

C．不受包装的限制。

因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。

D．可容易地测出外源DNA的插入取向。

E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。

B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。

C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ蛋白进E.coli细胞内，↓感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用下转变为双链DNA，称复制型DNA。

通过 结构进行几轮复制。

↓当基因Ⅱ产物在亲代RF DNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即告开始。

↓E.coli DNA聚合酶I以环状的MB负链模板合成正链的MB DNA(pdI将单核苷酸不断加到游离的3 -CH上合成(+)DNA)。

↓当复制叉环绕模板整整一周时，新合成的正链由基因II产物切去，经环化后形成单位长度的病毒基因组。

*1.只形成(+)DNA的原理：当每个感染细胞中合成出200个(+)DNA时，便会产生出单链结合蛋白质。

这种蛋白质通过同(+)链DNA结合，从而阻断了(-)链DNA的合成。

*2.单链DNA结合蛋白(即GeneV产物)的功能有如下两方面：①阻断GeneIImRNA的转译；②与新合成的(+)DNA结合，阻止其再转变成RNA/DNA。

图M13 phage在感染的E.coli Cell内的复制过程，前四步发生在感染后的15-20分钟。

导致每个寄主细胞内积累100-200个环状RF DNA分子，随后持续产生单链(+)DNA并形成子代病毒颗粒。

因此在感染的细胞内，RF DNA的分子数目和子代(+)DNA的产生速率都能够保持适度。

D．异常的形态发生(大的克隆能力)与大多数其他细菌病毒不同，M13并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒，而是在GeneV蛋白-DNA复制物移动至细菌细胞膜的同时，GeneV产物从正链上脱落，而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。

由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中，因此，对于可被包装的单链DNA的大小并无严格限制。

E．M13是非溶菌的，因此不会形成真正的噬菌斑，实验中所见到的M13噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致，其生长速率通常只为正常生长速率的1/2-3/4。

每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒，因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒，其效价可达1012pfu/ml。

二、M13克隆体系1．M13克隆体系A．M13mp载体系列是Messing et al., 构建的。

这个载体系列都是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来。

M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信息。

B．M13克隆体系的寄主菌寄主菌的F'因子含有缺陷型的β-半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽没有活性，并缺失第11-41位氨基酸。

这种寄主菌当其感染了没有外源DNA插入的M13时，在感染细胞中产生的β-半乳糖苷酶N端片段与寄主F'因子产生的缺陷型的β-半乳糖苷酶结合后，可形成具酶活性的蛋白。

*M13噬菌体之寄主菌株应用M13噬菌体载体进行克隆时的寄主菌株有：JM101，JM105，JM107，JM109，JM110，TG1，TG2，XL1-Blue，XS127，XS101，71/18，KK2186，MV1184，(FromSomebrook et al., 1989. P.211)2．M13克隆体系β-半乳糖苷酶显色反应原理*M13和相关寄主菌株如JM101。

由于它们单独均不能产生有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此单独均不能显色。

只有当M13 phage载体和JM101一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此可以显色。

A．X-gal显色反应原理具功能活性的β-lac是以四聚体形式存在的，它可将无色的底物X-gal：(X-gal: 吡喃半乳糖苷衍生物)5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切成半乳糖和深蓝色的底物-靛蓝：5-bromo-4-chloroindigo因此，X-gal可以作为检测β-半乳糖苷酶活性的一种有效的指示剂。

B．顺反子内互补作用或α-互补作用推理：*使M13体系显色最简单的办法是使之带上一个完整的lac操纵子，但这样的结果会使M13分子过大而不便于克隆操作。

*所以，应用DNA重组技术构建出只具β-半乳糖苷酶基因一小部分的M13派生载体。

这个片段编码β-半乳糖苷酶的氨基末端，即α-肽链。

*通过顺反子内互补测验(intracistroniccomplementation test)便可检测出这种α肽链的功能活性。

定义：所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。

举例：两个lac操纵子突变体：一个在染色体上Lac-一个在F质粒上Lac-当两者同处一个细胞内(部分二倍体)，两个lac突变体互补了，形成Lac+α互补作用：顺反子互补也可以多肽形式出现，例如M13克隆体系就是一个典型的例子。

Lac缺失突变lacZ(∆M13)简称M15↓合成一种缺失了11-41氨基酸的缺陷性的β-半乳糖苷酶，又称M15多肽。

这段缺失使该酶失去了四聚化作用的能力。

遗传标记lacZ∆M15：缺失突变体，缺失lacZ基因中的β-半乳糖苷酶N端部分编码序列。

∆M15所表达的小肽可以参与α互补。

M13 phage的许多寄主菌所携带的F'附加体都有这种缺失的lacZ基因变种。

但是，在体外加入野生型的β-半乳糖苷酶的溴化氰片段(cyanogens bromide fragment)(2-92氨基酸)就可以使M15多肽的活性得以恢复，重新获得形成四聚体的能力。

因此说溴化氰自然补偿了lacZ基因的M15突变，这种作用叫做α-互补作用：其中M15蛋白质多肽叫α-受体溴化氰片段叫α-给体M13-JM101互补作用：实验发现，用一种特定的β-半乳糖苷酶的HindII片段代替溴化氰片段，同样也可以发生α-互补。

在M13-JM101克隆体系中；M13噬菌体载体具有lac HindII片段，JM101 F质粒具有M15突变基因。

所以M13-JM101是可以实现α-互补作用的；可形成具功能活性的β-半乳糖苷酶。

克隆基因活性的调节：M13载体所携带的HindII片段上具有：lacI'lac启动子(P)lac操纵位点(O)lacZ'(α-肽链)4 个组成部分，简称lacZOPI片段。

*HindII片段=lacZOPI片段*由上述可见M13-HindII片段上不带有功能性的阻遏基因。

所以在被感染的细胞中， -半乳糖苷酶的合成将是组成型的：因为当M13噬菌体颗粒感染了E.coli细胞之后，很快就会累积约200个RF DNA/cell；假若其上带有HindII片段，那么普通的lac+细胞的阻遏状态将会随着HindII片段的复制而得以消除；这是因为每个细胞中都仅存有10个左右的阻遏物分子的缘故。

结果在感染的细胞中，lac结构基因的转录活动便属于组成型的。

*从组成型到诱导型的改造为了克服这种组成性，已将lac阻遏基因的I q突变引入寄主细胞。

这个I q突变基因可以产生出十余倍超量的阻遏物，所以这种突变的存在，寄主细胞就能合成出充足的阻遏物去补偿大量的M13 RF DNA分子。

在具有lacI q 突变基因的寄主细胞中，给lac操纵子加入一种诱导物，典型的是IPTG，就可以激活HindII片段的复制。

IPTG分子结构式IPTG的作用：*是一种含硫的乳糖类似物。

IPTG：isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷。

*这种类似物在没有乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成β-半乳糖苷酶。

所以我们称IPTG为β-半乳糖苷酶的安慰诱导物(gratuitous inducer)，亦即不发生代谢变化的诱导物。

*在X-gal显色反应中，β-半乳糖苷酶同样也需要诱导，但X-gal 不是一种诱导物，所以得在琼脂平板上加入IPTG。

JM101寄主菌株(及其它类似菌株)：在M13克隆体系中常用JM101菌株作寄主，该菌株染色体上的lacZ基因已经缺失了，但在它携带的F质粒上有一个M15基因和lacI q突变，这有两个方面的作用：*第一，可以产生出超量的lac阻遏物，这就使得lac操纵子的表达置于培养基中渗入的IPTG的调控之下。

*第二，当M13载体感染之后，通过α-互补作用，便会形成有功能活性的β-半乳糖苷酶。

在补加X-gal及IPTG的培养基中，就会出现蓝色的菌落。

3．M13载体系列的发展M13噬菌体要发展成克隆载体。