重组水蛭素口服给药的抗凝血效应阎雪莹1，唐晓飞2，张学农3，张强41黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 (150040)2黑龙江省哈尔滨市香坊区疾病预防控制中心，哈尔滨 (150031)3苏州大学药学系，浙江苏州 (215007)4北京大学药学院药剂系，北京 (100083)E-mail：yanxuey@摘要：目的：考察不同剂量重组水蛭素-2（rHV2）口服给药后的抗凝血效应。
方法：以凝血时间（CT－Clotting Time）和凝血酶时间（TT-Thrombin Time）为指标，测定大鼠口服不同剂量的rHV2的抗凝血效应。
结果：rHV2口服给药后，凝血时间及凝血酶时间试验均表现出显著的抗凝血效果。
而且从给药后1h到4h抗凝效应一直延续。
并且还可以说明这种抗凝血效应是有剂量依赖性的。
当剂量范围在50 mg·kg-1~100 mg·kg-1之间，抗凝血效应随着剂量的增加而加强。
结论：rHV2经大鼠口服后能够产生抗凝血效应，说明rHV2的口服是可行的。
关键词：重组水蛭素-2；口服；抗凝血；药效学中图分类号：R969.1 文献标示码：A1. 引言水蛭素是一种由65个氨基酸残基组成的多肽，是目前已知的作用最强的天然凝血酶抑制剂[1,2]。
由于多肽类药物易被消化道中的酶降解而失去活性，因此这类药物的给药途径以注射为主。
但频繁注射给病人带来很大的不适，因此开发水蛭素的口服给药制剂具有很大的价值。
韩玉珉等[3]证明重组水蛭素-2(rHV2)经十二指肠给药后表现出明显的抗凝血作用，但作用弱于注射给药。
本研究考察了rHV2口服给药后的抗凝血作用，进一步验证完整的胃肠道环境对于rHV2活性的影响。
从而为开发水蛭素口服给药制剂奠定了理论基础。
2. 实验材料2. 1 试剂与药品rHV2（4067 ATU·mg-1，北京大学生命科学院）。
凝血酶（54 U·mg-1，Sigma 公司）。
Tris HCl (Sigma 公司)。
2.2 主要仪器电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂）。
精密电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
秒表（上海手表厂）。
2.3 实验动物SD大鼠（♂，200g），维通利华实验动物中心。
3 实验方法3.1凝血时间（CT）测定方法称量rHV2，加生理盐水配成溶液。
大鼠随机分组，每组5只，分别按50 mg·kg-1，75 mg·kg-1，100 mg·kg-1的剂量灌胃给药。
灌胃体积2 ml。
给药前的凝血时间测定值设为对照。
在选定的时间点用毛细管从眼眶静脉丛取5cm长的血柱。
每隔20s折断毛细管一小截，检查有无凝血丝。
记录从毛细管采血至出现凝血丝的时间，即为凝血时间[3]。
3.2 凝血酶时间（TT）测定方法3.2.1 溶液的配制100U·ml-1凝血酶储备液：取一小瓶内含5000U的牛凝血酶，加入生理盐水5 ml使溶解，再加入硫酸钡100 mg，于37℃下温育20 min，将上清液移至0.85%生理盐水20 ml内，再加甘油25 ml，混合。
-20℃保存。
pH 3.5 Tris缓冲液：取Tris（一级生化试剂）6.0 g，氯化钠6.6 g，0.1mol·L-1盐酸440.0 ml，蒸馏水加至1000 ml，4℃下保存。
凝血酶工作液：取凝血酶储备液0.1 ml，加pH 3.5 Tris缓冲液0.6 ml混合，于37℃下温育20 min。
即为凝血酶工作液[4]。
3.2.2 测定步骤大鼠随机分组，每组5只，按50 mg·kg-1的剂量灌胃给药，在选定的时间点用毛细管从眼眶静脉丛取血。
血液用3.8%的柠檬酸钠溶液抗凝，血液与柠檬酸钠溶液的比例是8.75：1.25。
血液3000 rpm离心10min，吸取上层血浆。
取0.1 ml血浆于1.5 ml塑料离心管内，加0.1 ml37℃温育的Tris缓冲液，混合，37℃温育1 min。
在1 min末向离心管内加0.1 ml凝血酶工作液，同时启动秒表。
用注射器针头以每秒2次的频率在混合液内挑动，至形成凝块，停表，记录时间，即为凝血酶时间。
给药前的凝血酶时间测定值设为对照。
4 实验结果rHV2大鼠口服给药CT及TT测定结果见表1和表2。
表1 不同剂量rHV2大鼠口服给药CT测定结果(n = 5)Tab. 1 Results of CT at different time after p.o. administration of rHV2 at different dose (n = 5) 剂量(mg·kg-1) 对照组 (s) 给药1h (s) 给药2h (s) 给药3h (s)79.19±19.96**65.90±19.76*52.02±27.4250.0 51.99±13.04107.11±40.99**74.98±24.15*82.38±59.0575.0 31.64±8.4986.20±14.25**99.91±44.44*100.0 47.73±10.6673.55±23.20**与对照组相比，* p < 0.05，** p < 0.01表2 rHV2以50.0 mg·kg-1体重剂量大鼠口服给药CT 和TT测定结果(n = 5)Tab. 2 Results of CT and TT at different time after p.o. administration of rHV2 at a dose of 50.0 mg·kg-1 (n = 5)对照组（s）给药1.5h(s)给药4.0h(s)CT (s) 121.40±13.52 132.39±7.14* -TT (s) 22.02±3.13 35.77±16.18**26.26±7.23*与对照组相比，* p < 0.05，** p < 0.01表1为大鼠口服不同剂量的rHV2在不同时间点CT的测定。
可见三个剂量组都表现出显著的抗凝血效应。
当剂量为50.0 mg·kg-1，给药后1 h没有抗凝血效应。
但在2 h出现了显著的抗凝血效应(p < 0.01)。
3 h 时抗凝血效应减弱，但仍保持着显著性（p < 0.05）。
当剂量为75.0 mg·kg-1时，虽然给药1 h凝血时间延长，但是没有统计学意义。
在2、3 h出现了显著的抗凝血效应。
当给药剂量为100 mg·kg-1时，给药后1、2、3 h均出现显著的抗凝血效应。
而且1 h的抗凝血效应就特别显著（p < 0.01），这种显著性一直延续到3 h。
另一项实验是以50 mg·kg-1的剂量灌胃，在1.5 h同时测定CT和TT。
可见在给药后1.5 h凝血时间和凝血酶时间均有所延长（p < 0.05，p < 0.01）。
在给药后4 h测定TT，发现抗凝效应依然存在（p < 0.05）。
5 讨论韩玉珉等[3]曾做过经十二指肠给药后的抗凝血及抗血栓效应研究，所用的重组水蛭素比活为4000-5000AT-U·mg-1，与本研究所用的重组水蛭素活性相近。
结果表明，当给药剂量为50 mg·kg-1、71 mg·kg-1、100 mg·kg-1、141 mg·kg-1、200 mg·kg-1时均有明显的抗凝血作用。
而且抗凝强度随剂量的增加而增加。
给药剂量为50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1时，抗静脉血栓形成作用明显，且随剂量的加大其抗栓作用增强，对全血栓形成的影响尤其明显。
这个实验说明重组水蛭素是可以通过肠道吸收并起到抗凝血作用的。
有报道[4]称水蛭素可以被胃蛋白酶水解，丧失活性，因此胃部的生理环境对水蛭素的存活是个挑战。
十二指肠给药避过了胃蛋白酶的降解，使重组水蛭素得以存活，并进一步被吸收进入系统循环。
但是口服给药后会是什么样的情况还是个未知数。
目前尚没有水蛭素口服给药药效学方面的报道。
从本实验的结果来看，rHV2口服给药无论从凝血时间还是凝血酶时间都体现出显著的抗凝血效果。
而且从给药后1h到4h抗凝效应一直延续。
并且还可以说明这种抗凝血效应是有剂量依赖性的。
当剂量范围在50 mg·kg-1~100 mg·kg-1之间，抗凝血效应随着剂量的增加而加强。
这一点与韩的结论是一致的。
本实验没有给药4 h后的测定结果。
Bichler[5]报道水蛭素皮下（剂量分别为600 AT-U·kg-1、800 ATU·kg-1、1000 ATU·kg-1）及静脉注射（1000 ATU·kg-1）后TT时间明显延长，直到给药后7小时，仍然能检测到它的抗凝血作用。
说明rHV2的作用是持久的。
总之，以上的数据表明rHV2经大鼠口服后能被吸收入血，并能够产生抗凝血效应。
这说明rHV2的口服是可行的。
参考文献[1] Markwardt, F. Hirudin as an inhibitor of thrombin [M]. In: GE Perlmann and L Lorand, eds. MethodsEnzymol.19: Proteolytic Enzyme. New York-London: Academic Press, 1970. 924-932[2] Chang JY. The functional domain of hirudin, a thrombin-specific inhibitor [J]. FEBS Lett, 1983, 164: 307-313[3] 韩玉珉，陆峪峰，王朝晖，等. 重组水蛭素十二指肠给药后的抗凝血和抗血栓作用实验研究 [J].中华血液学杂志, 1999, 20: 483-484[4] 王朝晖，鹿峪峰，韩玉珉. 重组水蛭素HV2的稳定性[J]. 生物化学杂志，1995，11(3): 321-327[5] Bichler J, Fichtl B, Siebeck M, and Fritz H. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of hirudin in man aftersingle subcutaneous and intravenous bolus administration [J]. Drug Res., 1988, 38(1): 704-710The anticoagulant effect of recombinant hirudin 2 afterorally administrated to ratsYan Xueying1，Tang Xiaofei2，Zhang Xuenong3，Zhang Qiang41 Pharmaceutical College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin (150040)2 Xiangfang District Center for Disease Control and Prevention of Harbin city of Heilongjiangprovince，Harbin (150031)3 Pharmaceutical College，Suzhou University，Suzhou，Jiangsu (215007)4 Pharmaceutical College，Peking University，Beijing (100083)AbstractThe clotting time (CT) and thrombosis time (TT) were measured to assess the anticoagulant effect of recombinant hirudin 2 (rHV2) after orally administrated to rats. Both CT and TT showed the remarkably effects and the effects continued to 4h after administration. The effect is dose dependent at the dose of 50 mg·kg-1~100 mg·kg-1. These data showed that rHV2 has anticoagulant effect after oral administration; it could be administrated by oral route.Keywords：recombinant hirudin 2，oral administration，anticoagulant，pharmacodynamics作者简介：阎雪莹，女，1971-，硕士导师，主要研究方向是靶向制剂及天然药效成分的体内代谢。