第32卷第1期大连海洋大学学报Vol.32No.1 2017年2月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Feb.2017DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2017.01.019文章编号:2095-1388(2017)01-0111-08遗传和温度因素对鱼类性别分化相关基因表达及性别比例的影响闫浩1㊁2,梁利群1,常玉梅1,孙博1,苏宝锋1(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070;2.上海海洋大学水产与生命学院,上海201306)摘要:鱼类的性别决定机制较为复杂,是遗传和环境共同作用的结果,具有很大的可塑性㊂随着分子生物技术的不断更新,对鱼类性别决定及分化相关基因的鉴定和研究有了新的进展,环境因子如温度㊁光照㊁pH㊁低氧㊁水压等均能影响大多数鱼类的性别决定和分化过程㊂本研究中,阐述了鱼类遗传型性别决定(GSD)和温度依赖型性别决定(TSD)方式,并对TSD与遗传型性别加温度影响(GSD+TE)性别决定机制下,性别决定相关基因在雌雄异型中的表达及结合温度诱导性逆转进行概述,分析了温度对鱼类性别比例的影响,并提出今后应加强对性别决定基因的鉴定㊁解析和基因功能研究,为科学制定鱼类繁殖计划提供指导㊂关键词:性别决定;遗传型性别决定(GSD);温度依赖型性别决定(TSD);性别比例;温度效应中图分类号:S917.4 文献标志码:A 作为脊椎动物中最低等的鱼类,其性别决定和分化机制复杂多变,其中,性别是由遗传和环境因素相互作用共同决定的㊂性别决定和分化类型主要分为3类:遗传型性别决定(genetic sex determina⁃tion,GSD)㊁温度依赖型性别决定(temperature-dependent sex determination,TSD)和遗传型性别决定加温度影响(genetic sex determination plus tem⁃perature effect,GSD+TE)㊂鱼类性别决定除了受基因控制外还受到其生活环境影响,由于其生活环境复杂,环境影响在性别决定和分化中甚至强于遗传因素而发挥作用㊂这些环境因子包括光周期㊁温度㊁pH㊁盐度㊁溶氧量㊁水压等㊂其中,温度作为外界因素是最受关注的一个环境因子,温度效应影响性别决定和分化,从而影响后代的雌雄比例[1-2]㊂本研究中,对在TSD与GSD+TE性别决定机制下其相关基因在雌雄异型中的表达以及结合温度诱导性逆转进行了概述,以期为进一步探究鱼类性别决定及分化机制和生产实践提供参考㊂1　GSD和TSD型性别决定方式 在脊椎动物中,GSD和TSD型性别决定和分化具有不同的时空模式㊂GSD机制的受精卵在开始发育后,性别就已经由个体染色体的组成所决定,在此后的发育过程中,受环境因素影响很小㊂然而TSD机制发生在性腺形成前期或性腺分化决定期,此时个体对温度敏感,温度不可逆地改变了动物的性别㊂TSD机制是通过GSD发挥作用㊂据报道,到目前为止总共有13科59种鱼类的性别分化属于TSD型㊂但是Ospina-Álvarez等[3]认为,有试验证据的鱼类仅仅只有40种属于TSD型,其余19种鱼类可能由GSD和温度效应(GSD+TE)共同影响性别决定和分化过程㊂也有学者认为,即便是有试验验证的鱼类属于TSD,也可能仅代表某一个特殊地理位置的群体,比如在大西洋银汉鱼Menidia menidia中发现了依赖地理纬度的TSD群体,在高纬度地区生长的地理种群性别完全属于GSD性别决定方式,而在中间纬度的地理种群性别属于TSD性别决定方式;这可能是由于中纬度地区生长时间相对较长㊁温度相对较高的生产季节,有利于雌鱼生产[4]㊂蓝鳃太阳鱼Lepomis mac⁃rochirus中存在2种性别决定方式㊂对温度敏感的群体,TSD起主要作用,温度升高后雄性比例多于　收稿日期:2016-07-12　基金项目:国家自然科学基金资助项目(31461163004);中国水产科学研究院基本科研业务费专项(2016RC-YJ02);黑龙江省人力资源和社会保障厅 省留学回国人员择优资助”项目(黑人社函【2015】424号)　作者简介:闫浩(1989 ),男,硕士研究生㊂E-mail:yanhao_02@　通信作者:苏宝锋(1982 ),男,博士,助理研究员㊂E-mail:subaofeng@雌性;对温度不敏感的群体,温度变化对雌雄性别比例未有显著影响,但是存在遗传性别与温度效应相互作用的性别决定方式(GSD+TE)[5]㊂因此,在研究鱼类TSD机制中,研究人员还需要考虑该物种是否存在不同纬度的地理种群,这些不同的地理种群是否存在温度敏感家系或群体;当把受TSD 机制决定的群体置于极端温度可控制的环境中,研究人员还需要考虑该物种在自然界中适宜的生长温度变化等因素㊂现有研究表明,鱼类性别决定机制具有明显的不稳定性和性别分化的可塑性,这从一定程度可以证明GSD和TSD间的过渡假说[5-6]㊂有学者认为,无论是TSD㊁GSD,还是GSD+TE机制,在某些特定环境比如极端温度或实验室条件下,鱼类能够响应环境条件(如温度)的变化,从而可能导致性别比例的失衡[5]㊂温度效应对性别分化所涉及的下游信号通路和TSD是相同的,这从另一个侧面证实了鱼类性别决定机制的不稳定性和性别分化的可塑性㊂在漫长的进化过程中,鱼类胚胎和个体发育进化出适应各种自然环境的性别决定和分化机制㊂2　雄性决定相关基因及其与TSD和GSD+TE的关系2.1　Sox9基因Sox(Sry-related HMG-box)是一类与哺乳动物睾丸决定基因相关的基因家族的总称,在脊椎动物Sox基因家族中,共有40多个Sox基因成员㊂Sox基因在进化上相对保守,在雌雄个体基因组中均有存在,但在不同的物种间呈现出不同的表达模式[7]㊂在哺乳动物中,Sox基因家族的典型代表是Sry(sex-determining region of the Y chromosome)基因,对哺乳动物精巢的发育有着决定性作用㊂Sox9和Sry同属于HMG-box家族,HMG-box在哺乳动物不同物种间相对保守,发挥转录因子作用㊂Sox基因家族中与鱼类性别决定相关的基因主要是Sox3㊁Sox8和Sox9等,其中Sox9与精巢形成关系最为密切[8]㊂在对大多数鱼类如斑马鱼Danio re⁃rio㊁青鳉Oryzias latipes㊁三刺鱼Gasterosteus aculea⁃tus㊁黄鳝Monopterus albus和虹鳟Oncorhynchus mykiss等的研究中发现,Sox9基因有两个拷贝即Sox9a(Sox9a1)和Sox9b(Sox9a2)[9]㊂成年斑马鱼Sox9a基因在脑㊁肌肉㊁肾和精巢等多个组织中均有表达,但Sox9b基因只在卵巢中表达,表明Sox9a基因在精巢功能维持中发挥作用,Sox9基因在卵巢中可能获得了一些新的功能,这可能与鱼类复杂多样的性别决定机制有关㊂Sox9基因在青鳉卵巢中表达,在精巢中未检测到,通过系统发生学和序列比对发现,青鳉Sox9基因更接近于斑马鱼Sox9a基因,但Sox9基因在成年青鳉脑和卵巢中表达,这又和斑马鱼Sox9b基因表达相同,但是,斑马鱼Sox9b基因不在脑中表达,而青鳉Sox9基因却又在大脑中表达,推测青鳉Sox9基因具备斑马鱼Sox9a和Sox9b两个基因的功能特点[10]㊂Naka⁃moto等[11]为了搞清Sox基因在青鳉性别决定和分化中的作用,分离得到一种新的基因Sox9a2/Sox9b,成年青鳉Sox9b基因在脑㊁胸鳍和精巢中表达,在卵巢中不表达,这和斑马鱼Sox9a基因的表达模式相同,说明该基因与精巢形成有密切关系㊂在青鳉性别决定和分化早期,Sox9b基因在雌雄性腺间无差别表达;但是该基因在雄性精巢表达的同时,伴随着Dmy基因的表达,而Dmy基因在卵巢中却不表达㊂随后,Sox9b基因只在精巢中表达,而在卵巢中的表达受到抑制,表明Sox9b基因可能不参与青鳉早期的性别决定和分化,但参与精巢的维持[12]㊂Nakamura等[13]通过转基因和嵌合基因获得青鳉Sox9b基因突变体,证实Sox9b基因不直接参与性别决定和分化,但对生殖细胞的维持是必需的㊂Sox9仅在尼罗罗非鱼Tilapia nilotica精巢分化的后期特异性表达,它参与精巢的形成,而不参与雄性性别的决定或精巢的分化[14-15]㊂杨超[16]在研究尼罗罗非鱼Sox家族成员过程中,报道了Sox9a/Sox9b在正常性腺发育过程的表达模式,同时利用TALEN技术对Sox9a/Sox9进行基因敲除,发现Sox9b可能参与了雌激素合成酶Cyp19a1a的转录调控㊂另外Sox9a对精原细胞的减数分裂及精原细胞㊁精母细胞和精小叶的维持有着重要作用㊂2.2　Dmrt1基因Dmrt(double-sex and mab-3related transcrip⁃tion factor)基因是指与果蝇Dsx(double-sex)基因和线虫Mab-3基因同源的基因[17]㊂它是一类下游性别决定基因,它编码的转录因子具有一个保守的DM(double-sex and male aberrant-3relative do⁃main)结构域,靠特殊的锌指样结构方式连接特定的DNA序列及调控下游基因的表达来发挥作用,在雄性性腺发育过程中发挥重要作用,调控性别决定和性别分化㊂不同物种间性别决定与分化的作用机制表现出复杂的多样性,然而参与性别决定的下游基因相对保守[18]㊂Dmrt在基因结构和功能上具211大连海洋大学学报 第32卷有保守性㊂奥利亚罗非鱼Dmrt1与尼罗罗非鱼㊁黑鲷Sparus macrocephlus㊁黄鳝㊁新月鱼Xiphophorus maculatus㊁虹鳟等鱼类的Dmrt1氨基酸序列同源相似度分别为99%㊁80%㊁78%㊁73%㊁62%,说明Dmrt1基因在不同鱼类中具有同源性[19]㊂在硬骨鱼中,Dmrt1基因在不同种类中的表达模式有所不同㊂对半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Dmrt1α基因cDNA克隆与表达的研究发现,Dm⁃rt1α基因只在雄性精巢中表达,在雌性卵巢及雌雄鱼鳃㊁脾㊁肝㊁肾等组织中不表达,具有组织特异性㊂另外,Dmrt1α基因也在性逆转成功的雄鱼中表达,而在性逆转未成功的雌鱼体内没有检测到,说明Dmrt1α基因可能在半滑舌鳎精巢形成中发挥作用[20]㊂王婷茹[21]通过组织细胞定位研究发现, Dmrt1基因特异性表达于尼罗罗非鱼精巢支持细胞中㊂在雄性尼罗罗非鱼性别决定的关键期5dah (days after hatching)敲除Dmrt1基因,精巢发育畸形不能产生正常的生殖细胞[22]㊂在用雌二醇和芳香化酶抑制剂对尼罗罗非鱼进行诱导性逆转的试验中发现,在性腺决定的关键期(3~5dah)使用药物诱导性逆转,尼罗罗非鱼体内雌雄两个通路同时被打开㊂如果Dmrt1基因参与的雄性通路受到抑制,则性腺朝着卵巢方向发育;相反,如果Cyp19a1a基因参与的雌性通路被抑制,则性腺朝着精巢方向发育[21]㊂这些结果均表明,Dmrt1基因可能在雄性性别决定和分化中发挥重要作用㊂Dmrt1基因家族内,家族成员基因存在组织和时间表达差异性㊂Dmrt1基因在牙鲆Paralichthys olivaceus的原始性腺㊁性腺分化期和分化的卵巢中表达水平均较低,在分化的精巢中表达强度迅速上升;Dmrt4在原始性腺中高表达,在其后性腺分化期间表达量降到较低水平,然后在分化的精巢中又呈高表达[23]㊂Winkler等[24]发现,青鳉的Dmrt1a 和Dmrt2-4在早期性腺中未检测到表达,但在幼体发育分化中的性腺和雄性成体性腺中均有表达㊂关于环境温度对鱼类Dmrt1基因表达量的研究只在少数几种鱼中有报道㊂在高温诱导尼罗罗非鱼性别分化相关基因表达分析中发现,将温度敏感期的幼鱼分成3组(诱导组㊁恢复组和对照组),诱导组雌鱼性腺中Dmrt1基因表达量显著上调,这与高温诱导半滑舌鳎雌鱼性逆转为雄鱼性腺中Dmrt1表达量上调㊁未性逆转成功的雌鱼性腺中Dmrt1未表达的研究结果相同[25]㊂在对欧洲鲈鱼Dicentrar⁃chus labrax的研究中发现,150~200日龄鱼的性腺中Dmrt1基因表达量持续上升,200日龄后雌性卵巢中Dmrt1表达量开始下降,300日龄时雄性精巢中Dmrt1表达量达到卵巢的6倍[26]㊂说明Dmrt基因在性腺发育形成早期的表达比较保守,之后在雄性性腺中表达较高,而雌性则相反,同时也说明Dmrt1基因在卵巢维持阶段并非是必需的㊂与尼罗罗非鱼不同,Dmrt1基因在欧洲鲈鱼性腺中的表达时间晚于性腺分化(90日龄)时间,表明该基因与高温诱导雄鱼机制间不存在必然联系㊂综上所述,Dmrt1基因在不同鱼类表现出不同的表达模式,但可以肯定,该基因在精巢分化与高温诱导性逆转的过程中发挥了重要作用,但解释该基因在性腺发育机制过程中发挥的具体作用还需进一步研究㊂2.3　Amh基因Amh抗缪勒氏管激素(Anti-müllerian hor⁃mone),也称抗缪勒氏管抑制因子㊂缪勒氏管即为输卵管的前身,属于TGF-β家族成员,由Stertoli 细胞分泌,与其他TGF-β家族成员不同,Amh主要通过Amh/AmhII通路在性腺分化和发育中发挥作用㊂在雄性哺乳类㊁鸟类和爬行类中,Amh由睾丸支持细胞分泌,具有使缪勒氏管退化作用;在雌性动物卵巢中,Amh主要由颗粒细胞分泌,少量在卵巢膜细胞表达,抑制雌性生殖器官形成㊂因此, Amh基因在雄性性别决定和分化中起到重要作用㊂缪勒氏管结构只存在于某些古老的鱼类如鲟鱼中,目前所报道的近代硬骨鱼类中不存在此结构㊂在硬骨鱼类中虽然没有缪勒氏管,但在幼鱼发育和成熟的性腺中也检测到了Amh基因的存在,且在雌雄性别间呈二态性表达,说明Amh可能参与性腺的分化和雄性性腺的维持㊂在斑马鱼㊁鲑㊁尼罗罗非鱼中,Amh基因在性腺未分化阶段均呈低水平表达;而在性腺分化过程中,它在精巢中的表达量要显著高于卵巢㊂但也有例外,例如青鳉从孵化到性腺分化再到性成熟过程中,Amh基因在不同性别分化阶段中的表达水平均无显著性差异[27]㊂通过Western blot技术对尼罗罗非鱼的研究发现,成鱼性腺组织中Amh基因均有表达㊂利用免疫组化技术对Amh基因进行定位发现,Amh基因在卵巢颗粒细胞和鞘膜细胞中表达,在精巢中表达于Stertoli细胞[17]㊂这与Rodríguez-Marí等[28]对斑马鱼的研究结果相同㊂在对Amh基因在半滑舌鳎胚胎发育过程不同时间节点的作用研究中发现:受精后20㊁25h,Amh表达量显著高于其他时间段;在孵化后至70d前,Amh基因表达量在雄性鱼中311第1期闫浩,等:遗传和温度因素对鱼类性别分化相关基因表达及性别比例的影响一直处于较低水平,在70d时达到峰值;而在卵巢中呈现先上升后下降的趋势,孵化后133d达到峰值;但8月龄的雄性半滑舌鳎Amh基因表达量出现一个低谷,其原因可能是雄激素和生精细胞共同抑制了Amh的表达[29]㊂用E2诱导雄性尼罗罗非鱼和半滑舌鳎性逆转中发现,Amh基因表达不明显㊂用芳香化酶抑制剂诱导雌性尼罗罗非鱼和半滑舌鳎时发现,Amh表达量逐渐上升[21,29]㊂推测Amh基因在精巢决定和分化中发挥重要作用㊂另外还发现,Amh基因的表达受外部激素的影响,将斑马鱼暴露于17α-E2中,Amh基因表达明显受到抑制,同时精巢发育受阻或停滞[30]㊂目前,关于鱼类中Amh基因及在AmhR-II信号通路中的功能研究较少,还需进一步探究㊂3　雌性决定相关基因及其与TSD和GSD+TE的关系3.1　Cyp19a1a和Cyp19a1b基因芳香化酶是一种催化雄激素合成雌激素的关键酶和限速酶㊂芳香化酶的主要作用是将某些雄激素(睾酮等)转化为雌激素,促进肝脏中卵黄蛋白原的合成及卵子中卵黄的形成与积累,为卵细胞的发育提供能量保证[31]㊂但是,过高的芳香化酶生物活性反而使17α㊁20β-黄体酮的合成受到抑制,阻止了卵母细胞的正常成熟和排卵㊂在硬骨鱼类中,有两种基因编码Cyp19a1a和Cyp19a1b㊂Cyp19a1a基因也称作性腺(卵巢)芳香化酶基因(或P450aromaA),其主要在分化和成熟的性腺中表达;而Cyp19a1b基因又称作脑芳香化酶基因(或P450aromaB),在脑中大量表达[32-33]㊂随着分子生物学技术的发展,研究人员对芳香化酶的表达进行了细胞定位,发现大多数硬骨鱼类Cyp19a1a 基因主要在卵巢颗粒细胞和间质细胞中表达,而关于其在脑组织中的表达情况却较少报道㊂Cyp19a基因的表达具有时空特异性㊂在鱼类性腺分化前和分化中均可以检测到Cyp19a的表达,它和温度诱导鱼类性逆转有直接关系[34]㊂在牙鲆性腺未分化之前(50dah),Cyp19a在雌雄群体中无差异表达㊂但在性腺开始分化后(60dah), Cyp19a在牙鲆雌性性腺中表达量显著上升,然而在雄性性腺中却明显下降[35]㊂此外,Kitano等[35]报道:在高温诱导牙鲆雌鱼性逆转为雄鱼过程中, Cyp19a基因的表达受到抑制;研究中还表明,低表达量的Cyp19a是精巢分化的必须条件,高表达量的Cyp19a在卵巢分化过程中必不可少㊂还有研究表明,牙鲆在性腺分化过程中促卵泡素(FSH)和Foxl2参与了Cyp19a的转录调控,高温抑制Foxl2和FSHr基因的表达[36]㊂对尼罗罗非鱼体内和体外试验证明了Foxl2依靠其自身叉状结构域,结合在Cyp19a基因的启动子ACAAATA序列,从而激活Cyp19a基因的表达㊂然而在欧洲黑鲈中,高温诱导Cyp19a启动子区域甲基化,通过阻止Foxl2和sf-1结合在启动子区域,抑制了Cyp19a 在温度诱导的雄鱼中表达[37]㊂在尼罗罗非鱼中, Dmrt1通过抑制Ad4BP/sf-1的活性抑制Cyp19a的表达,Dmrt1通过抑制Cyp19a的转录表达和雌性激素产生抑制雌性性腺分化[21]㊂这些研究表明, Cyp19a基因是一个下游性别决定基因,上游基因可能激活了未分化的性腺转化为卵巢和精巢㊂用芳香化酶抑制剂处理尼罗罗非鱼和青鳉,可使雌性的卵巢组织向精巢组织过渡,雌激素合成受阻,说明雌激素在已分化的卵巢组织维持中发挥了重要作用㊂利用CRISPR/Cas9基因敲除技术在雌性尼罗罗非鱼卵巢中成功敲除Cyp19a1a基因,结果4月龄雌鱼卵巢性逆转为精巢结构,表明Cyp19a1a基因在尼罗罗非鱼的性别决定和分化中发挥着重要作用㊂同样,敲除雌性尼罗罗非鱼Cyp19a1b基因,5月龄的雌性个体与对照组相比,原始生殖细胞不能进行正常的减数分裂,卵原细胞发育停滞,卵巢不能正常发育㊂通过ELISA测得雌鱼血清中雌激素水平显著降低㊂将Cyp19a1a基因在雄性尼罗罗非鱼中过量表达,结果显示,雄鱼不会发生性逆转,其原因可能是雄性个体性腺发育的早期阶段多数类固醇激素合成基因(包括Cyp19a1a和Cyp19a1b)未表达,因此,缺乏类固醇类激素的合成途径,所以即使在雄性个体中过量表达Cyp19a1a基因也不能促使其向卵巢方向转化,即不会发生性逆转[38]㊂Cyp19a1a基因的表达与温度密切相关,并且Cyp19a1a基因可能是性别决定通路上的下游基因,不参与早期的性别决定,但在性别分化过程中发挥作用㊂尼罗罗非鱼性腺形态学分化前,雌性个体中Cyp19a1a的表达量显著高于雄性[39],说明Cyp19a1a基因在尼罗罗非鱼性腺决定及分化过程中发挥作用㊂在大西洋比目鱼Hippoglossus hippo⁃glossus的研究中也有类似结果[40]㊂欧洲鲈鱼无论在性腺分化前还是性腺分化中,即便高温诱导会产生更多的雄鱼(73%),Cyp19a1a基因表达量在雄性和雌性生产温度下也未有显著差异[41]㊂411大连海洋大学学报 第32卷在大多数具TSD的硬骨鱼中,通过高温处理使Cyp19a1a基因启动子甲基化和诱导Dmrt1基因的表达来使Cyp19a1a基因表达量下调,使雌激素的合成受到抑制,进而导致雌性通路的发生受到抑制[5,42]㊂尽管对Cyp19a1a基因下调在卵巢发育过程中的作用还存在不同的说法,但可以肯定的是,在鱼类性别决定及分化机制中该基因是一个很好的性别标记基因,并发挥着重要作用㊂3.2　Foxl2基因Foxl2(forkhead domain transcription factor gene 2)叉头状转录因子,是一种在眼睑㊁卵巢颗粒细胞和卵巢维持中发挥重要作用的转录因子㊂Foxl2基因发生突变会导致眼睑畸形和卵巢退化[43]㊂该基因在哺乳动物中被确定为雌性相关基因,并参与早期卵巢的发育和分化,与卵巢功能的维持相关,呈现明显的性别二态性,雌性中的表达量显著高于雄性[44]㊂对稀有鮈鲫Gobiocypris rarus Foxl2基因表达研究发现,Foxl2在肝㊁肌肉㊁鳃等组织中均有表达,在卵巢中的表达量显著高于精巢[45]㊂硬骨鱼类Foxl2基因的表达呈特异性表达模式,并与Cyp19a1a基因的表达呈正相关㊂Wang 等[46]对尼罗罗非鱼的研究发现:Foxl2基因能够直接促使Cyp19a1a基因激活影响雌激素的合成,从而对卵巢的发育产生影响;另外,Foxl2基因还能够与sf-1基因结合,从而增强sf-1对Cyp19a1a基因的调控㊂在对牙鲆的研究中发现,Foxl2基因可直接调控Cyp19a1a基因的转录[36]㊂在对南方鲶Paralichthys lethostigma㊁虹鳟㊁稀有鮈鲫Foxl2基因的研究中发现,用雌激素处理后其体内Foxl2基因表达量上调,对应的Cyp19a1a基因表达量上升, Dmrt基因表达量下降㊂用芳香化酶抑制剂或雄激素处理Foxl2基因表达量下调,Cyp19a1a表达量也随之下降,这些结果均表明,Cyp19a1a基因的表达受Foxl2的调控,表明Foxl2基因是雌性性腺分化与维持的重要调节因子[47-49]㊂在对青鳉的研究中发现,Foxl2基因与Cyp19a1a基因的表达在时间上有较大差异,用外源雌激素处理并不能直接使Foxl2表达上调[50],因此有学者认为,只有Foxl2基因不足以引发Cyp19a1a基因的表达,也许存在其他因素来调控Cyp19a1a表达㊂对鲶鱼的研究中还发现,通过Ftz-F1和Foxl2的协同作用结合特定的启动子使Cyp19a1a基因表达上调[49]㊂在青鳉孵化的早期阶段,Foxl2在雌雄性腺中均有微弱表达,随后Foxl2基因的表达贯穿于整个卵巢发育的颗粒细胞中,在卵黄泡发育后期,成熟的卵泡内Foxl2基因表达消失,然而在精巢中也未见其表达[50]㊂Foxl2并不是性别决定基因,但在卵巢分化后Foxl2开始表达,说明Foxl2基因在颗粒细胞的分化和卵巢的维持中发挥作用㊂在对具TSD牙鲆的研究中发现,性腺分化的敏感期,不同的温度处理对性别比例会产生明显的不同作用,在牙鲆性别决定期(30~100dah),高温(27℃)处理使雌鱼性逆转产生全雄鱼,正常温度(18℃)养殖使雄鱼性逆转产生全雌鱼,在高温条件下性腺中Foxl2基因表达受到抑制,表明Foxl2基因可能参与具TSD鱼类雌性的性别决定和分化过程[36]㊂4　温度对鱼类性别比例及生产的影响对大多数硬骨鱼类的研究发现,影响性腺早期分化方向的有效温度处理时间,应该在组织学性腺分化前或至少与其同步[51]㊂奥利亚罗非鱼在34℃时产生97.8%的雄性后代,在27℃时雄性率为63%,在21℃时性腺分化时间延长,表明高温会使奥利亚罗非鱼偏雄性化[52]㊂Azaza等[53]对尼罗罗非鱼研究发现:在温度为26㊁30℃时,尼罗罗非鱼的平均体质量显著高于22㊁34℃时;在26㊁30℃时,饲料转化率及日增重更好;当温度超过阈值36.9℃时,存活率降低为60%~81%,表明当温度升高到一定程度会明显降低存活率㊂另外,在牙鲆和金鱼Carassius auratus水产动物中发现,高温时鱼体均有利于向雄性化趋势发展[54-55]㊂Luckenbach等[56]在对牙鲆研究中发现,高温和低温均会使雄性率增大,28℃时雄性率为96%, 18℃时雄性率为78%㊂在不同温度处理下,欧洲鲈鱼的雌雄比例和死亡率均有显著性差异,在15℃时雌性率最高,但是生长速度减慢,死亡率升高㊂将受精卵放到17℃环境培育至53日龄,可以使鲈鱼雌性率和生长速度达到一个平衡,更好地用于集约化生产[41]㊂温度敏感期和鱼的个体生长㊁性腺分化发育间存在相互关联㊂对大西洋银汉鱼的研究发现,温度敏感期与体长(8~21mm)有关,过了这个阶段即使温度改变对性别比例也没影响;高温导致雄性化,低温导致雌性化[57]㊂对斑点叉尾鮰的研究表明,性腺分化与年龄㊁体长和温度有一定的相关性,PGC最早出现于7dah(体长为10~10.5 mm)分化的性腺中,卵巢的分化发育关键时期为受精后22~90d,精巢的分化发育关键时期则为90~102d,在受精后10~24d连续用高温(34511第1期闫浩,等:遗传和温度因素对鱼类性别分化相关基因表达及性别比例的影响℃)处理可以诱导高比例的雌性(1.68雌∶1雄)[58]㊂水产动物性别决定及分化具有很大的可塑性,环境温度确实能改变水产动物的性别决定和性腺发育分化过程㊂通过改变培育受精卵㊁仔鱼和幼鱼的水体养殖温度,可以改变鱼类的性别比例㊂在雌㊁雄鱼经济性状差异较大的养殖鱼类中,通过联合雌核发育㊁杂交育种㊁温度诱导等遗传育种手段,可以生产单性种群[59]㊂牙鲆 北鲆1号”的培育过程就是采用了雌核发育技术和温度诱导的育种手段,待牙鲆雌核发育的二倍体孵化后,在30~100日龄利用高温(28℃)可以诱导伪雄鱼产生;通过控制温度达到培育全雌鱼苗,以提高养殖产量和获得经济价值高的商品鱼,是一种既简便环保同时又具备实际应用价值的人工诱导性别分化方式[60]㊂5摇存在问题及展望目前,对于鱼类性别决定及分化机制的研究主要存在如下问题:(1)随着全球气候变暖,自然水体的温度也将升高,这很有可能改变自然水体中温度敏感鱼类群体的性别比例;鱼类性别比例的改变又可能导致该种群的灭绝[61]㊂对于某些温度敏感群体,它们可能不能迅速适应全球变暖所带来的不良影响㊂(2)目前,常使用外源性激素来诱导鱼类性别分化㊁培育单性鱼苗供水产养殖的方法存在一定隐患,可能会带来食品安全性风险,损害消费者健康,影响水生态环境㊂(3)在研究外界环境对鱼类的性别决定及分化影响中,温度是研究最多的因子,其他环境因子是否也能影响其分化过程,现在还尚不清楚㊂(4)在利用温度对鱼类进行性别控制中,应考虑在加热和制冷过程中对生产设备及技术的要求,是否能产生更大的经济效益㊂(5)性别分化前后,相关基因的表达上调或下调是鱼类性腺发育的原因还是结果,目前尚不清楚,鱼类性别多基因决定的具体作用模式也不清楚[62]㊂近年来,随着高通量测序技术的快速发展和测序平台的不断完善,对物种进行de novo测序和重测序的成本大大降低,水产动物性别决定和分化相关基因筛选研究取得了一些重要进展㊂加强对水产养殖物种基因组资源的挖掘有助于性别决定基因和信号通路的发现,这将在一定程度上助力性别控制技术和单性苗种的培育研究㊂目前,虽然对外界环境因素影响鱼类性别决定和分化的具体作用机制还不十分清楚,但随着分子生物学和遗传学的不断发展,将会使研究者更深入地从分子水平解释鱼类性别决定和分化机制㊂此外,结合基因敲除和基因编辑技术的开发与应用,可以加强对性别决定基因的鉴定㊁解析和基因功能性研究,这为实现苗种的人工性别控制,阐明鱼类性别决定和分化机制提供了重要的技术手段㊂参考文献:[1]　周贺,李佳奇,马海艳,等.低温诱导红鳍东方鲀雄性化及性腺分化的组织学观察[J].大连海洋大学学报,2015,30(1):41-47.[2]　Hayashi Y,Kobira H,Yamaguchi T,et al.High 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