共沉淀剂特点
共沉淀分离法中所使用的常量沉淀物质叫做载 体（也称共沉淀剂） 良好的选择性； 定量性，能定量沉淀微痕量物质； 不干扰测定（或者至少易被除去或掩蔽）； 便于与母液分离，易洗涤和过滤； 共沉淀效率高。
共沉淀法的应用
• 是目前分离和富集微量放射性物质的常用方法 之一 • 特别用在环境和生物样品的放化分析，如60Co 的分析 • 净化放射性废水和沾污的饮用水 • 药物促排，如亚铁氰化物共沉淀促排体内的 137Cs
有机溶剂沉淀法
影响因素及控制
A、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T 显著升高，对不耐热的pro影响较大。解决办法：搅拌、 少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力。另一 方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度 越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度 控制在-10C下进行。 B 、 [ 乙醇] ：通常随 [ 乙醇 ] 上升， pro 溶解度下降。如血纤维 蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当 乙醇浓度为40%时达到最小。 C、pH值：在确定了[乙醇]以后，pro最低溶解度出现在蛋白. 的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。 D 、 [pro] ：避免使用很稀的浓度，因 pro 在高浓度下才较稳 定。
非离子型聚合物沉淀法
优点： A、体系的温度只需控制在室温条件下； B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性； D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。 缺点： A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超 滤和液-液萃取来解决； B、价格较昂贵。
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非蛋白的杂质夹带沉淀很少；
适用范围广；
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盐份含量高。
阴阳离子盐析效果
阴离子盐析效果
柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN阳离子盐析效果 NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 硫酸铵
优点：溶解度大（769g/L,25℃) 对温度不敏感（679g/L,0 ℃ ） 分级效果好 稳定蛋白质结构的作用 缺点 缓冲能力差 需要脱盐
盐析法
结论： a 不同种类的盐主要影响Ks； b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。 无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能； b 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； c 溶解度受温度的影响小； d 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； e 不易引起蛋白质的变性； f 价格低廉； 最常用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低， 在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。 次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。
盐析作用强；
盐析能力——阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子
较大溶解度； 较好生物相容性； 来源丰富、经济；
2）常用盐析剂——硫酸铵、硫酸钠
5 盐析过程的影响因素
蛋白质种类和浓度 盐析剂的量 pH值 温度
7 盐析沉淀法的特点
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沉淀条件温和，不会引起生物物质变性失活；
• PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且
对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀法能在室温下进 行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。
• PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20 000。
所用的PEG浓度通常为20％，浓度再高，会使粘度增大，
造成沉淀的回收比较困难。PEG对后续分离步骤，影响 较少，因此可以不必除去。但它的存在会干扰A280和 Lowry法测定蛋白质。
有机共沉淀法
• 富集倍数高，选择性好，已应用于放射化学的 分离 • 形成过程：无机离子 → 疏水性离子或化合物 → 选择适当的有机化合物作载体 → 共沉淀↓
– 生成难溶的离子缔合物，如137Cs+ + 四苯硼酸根 → – 生成难溶的金属螯合物或缔合物，如U + α-亚硝基β-萘酚 → – 利用有机胶体的吸附作用而生成共沉淀
非离子型聚合物沉淀
定义
许多水溶性非离子型聚合物，特别是PEG可用来进
行选择性沉淀以纯化蛋白质。
原理
聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化
பைடு நூலகம்度，使蛋白质沉淀。
使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量PEG：而
使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。
非离子型聚合物沉淀法
某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是 PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产 品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用 PEG-6000 或 PEG-4000。 计算公式： 式中，S-溶解度；c-PEG浓度；β-常数，受溶液条件的影 响(如pH值和离子强度)；K-常数，由pro大小和PEG的类 型决定。 适应条件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/L和 高浓度蛋白质，如75g/L和150g/L时，实验结果会偏离线 性。这时方程需校正
机理：
A 、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常 数降低，而使 pro 分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝 集和沉淀。 B 、有机溶剂使 pro 溶剂化，使原来与 pro 结合的水被溶剂所取代， 从而降低了 pro 溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮 的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀 pro 的能力强，也解释不了丙 酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变 性，而盐析脱水时不造成pro变性。 C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂， 可见作用有机溶剂使 pro 在沉淀和变性之间既有区别又相关联。
沉淀分离法及应用
共沉淀法 cooprecipitation method
镭的发现
居里夫妇发现镭时就采 取了共沉淀分离法中的 分级结晶技术。
• 应用最早，1898年Curie夫妇提取了Po、Ra； • 优点是简单、富集倍数高、可用于直接制源， 其缺点是分离效率和回收率低、废液量大、难 于连续自动化
盐析法分离
1. 定义—— 在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解 度减低而产生沉淀的过程。
特点——浓缩倍数高、操作简便、经济、纯化倍数低等
2. 盐析沉淀机理 减弱静电斥力 去水化膜
等电点（isoelectric point）
• 定义：两性离子所带电荷因溶液的pH值不 同而改变，当两性离子正负电荷数值相等 时，溶液的pH值即其等电点。
aa：amino acid
酸性aa —COO- 碱性aa —COO-OOC — + HN — aa—NH + 3 aa—NH + 3 3
溶液的PH值＜7 须加入较多的酸才能使aa 正负离子量相等 等电点＜ 7
须加入碱，才能使负离 子量增加。 等电点＞7。
等电点时电荷中性 ——分子表面缺乏亲水的离子层 ——此时分子溶解度最小，可用于分离不同分子
有机溶剂沉淀法
优点： A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较 高， B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂 本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂； 缺点： A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦； B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性； C、收率也比盐析法低； D、试剂易燃，有毒。
基本原理
• 定义：利用微量物质随常量物质一起沉淀来进 行分离富集和纯化微量物质的方法。 • 分类：按沉淀剂的不同分无机共沉淀法和有机 共沉淀法 • 无机共沉淀法按作用机理的不同又分为：
– 混晶共沉淀法：选择性高、分离效果好，可用于微 量放射性核素的分离 – 吸附共沉淀法：清扫共沉淀，可用于水的净化，但 由于选择性差，不适合于多种放射性核素特别是化 学性质相似的元素分离
有机溶剂沉淀法
同盐析一样，随着沉淀 剂 —— 有机溶机浓度的上 升，蛋白质溶解度也呈指 数规律下降。
式中, So为当（K/e2） 0 时 S 的外推值； e 为水 - 有 机溶剂混合物的介电常数； K 为常数 ( 水的介电常数的 吸收系数)。
有机溶剂沉淀法
有机溶剂的种类：
丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。
盐析法
C、温度T 主要考虑不能影响主要产 物 的 活 力 , 即 在 其稳定的 温 度 下 盐 析 , 可 通过实验 决定 , 一般来说 , 温度越低 , 形成沉淀越不易 , 但也有 相反的情况 . 实际上 , 盐析 的 温 度 范 围 较 大 , 所有一 般都在常温下盐析.
等电点沉淀法
等电点沉淀法中的pH值作用于 β值而隐含在Cohnx公式中， pI 值通常在 pH4~6 范围内变 化，一般用无机酸（如盐酸、 磷酸和硫酸）作沉淀剂。 在蛋白质疏水性比较大和结合 水比较小时这种类型的沉淀 更有效。为了提高等电点法 的沉淀能力，常将其与盐析 法、有机溶剂法或其他沉淀 法一起使用。 最大缺点：无机酸会引起较大 的蛋白质不可逆变性的危险。
OA-卵清蛋白 COHb-碳氧血红蛋白 OA
７ ６ ５ ４ ３
lgS= β－Ｋs m
β随pH 变化 （1）对数关系 （2） 等电点附近有极小值 β随温度变化 随温度升高减小，热促失水膜
COHb 3 4 5 6 7 ８ 以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵 沉淀OA时，β随 pH的变化
用盐析法分离蛋白质的二种方法
等电点沉淀与分离
pH=pI 溶解度最小
大部或全部沉淀下来 pH<pI或 pH>pI
仍留在溶液中
蛋白质的分离 沉淀出来的蛋白质可保持天然构象，能再溶解 于水并具有生物活性。
蛋白电泳 Protein Electrophoresis
