（2）在细胞内过量表达该基因，观察各种功能影响。 （3）在细胞内抑制该基因表达，分析细胞功能变化；
建立基因剔除小鼠，分析基因产物功能。 （4）分析与该基因产物相互作用分子，或者是相互
作用的蛋白分子或核酸。
二、制造生物活性蛋白
基因工程技术的发展在医学上最重要的成就表 现在治疗用生物活性蛋白或疫苗的生产和使用。
新的技术
非定位候选基因克隆策略 (position-independent candidate gene approaches)：
直接根据分子病理学变化和基因组作图中各种 基因产物功能的了解预测出候选致病基因。
定位候选基因克隆策略 ( positional candidate gene approaches)：
基因操作与医学 (ppt)
优选基因操作与医学
基因操作技术在医学方面的价值主要包括：
（1） 疾病相关基因和疾病分子机制的分析家； （2） 建立新的疾病诊断方法--基因诊断； （3）发展出新的法医学鉴定方法--法医学鉴定； （4）纠正人类基因缺陷的方法--基因治疗；
（5）高效率、低成本地生产用于疾病防治的生物 活性蛋白质、细胞、器官。
一旦致病基因的染色体定位得以确认，可以利 用因特网上的基因网站所提供的基因序列数据鉴定 出候选致病基因。
（三）基因结构和产物功能的分析
——利用对于某基因结构和功能的理解，分析其与 疾病的关系、是否有突变、突变产物的致病机制。
获得未知基因后可进一步进行下列工作：
1．克隆和分析全长cDNA序列：根据cDNA序列推出 该基因编码的蛋白质的氨基酸序列； 2．克隆基因全序列：分析存在的内含子，启动子 以及其调节位点，探讨基因表达调控方式；
包(DMD) 致病基因的克隆：
首先，遗传学的家族连锁分析确 定了致病基因位于Xp21（性染色体X 短臂第2区第1条带）。
将病人的Xp21 DNA与ห้องสมุดไป่ตู้常人的杂 交，从而减掉了相同的基因序列，最后 剩余的序列即为病人缺失的基因。
适应症
注射疫苗用于预防乙型肝炎 糖尿病 垂体功能低下 急性心肌梗塞 慢性髓系白血病，骨髓瘤 乙型肝炎，艾滋病人并发kaposis肉瘤 多发性硬化（试用） 抗贫血* 肾性贫血 化疗后白细胞和内体骨髓移植再生* 严重烧伤 血友病A，B 血友病A，B 肿瘤免疫治疗 化疗后促进髓母细胞形成 免疫缺陷病，肿瘤，免疫佐剂 骨髓移植前扩增骨髓干细胞 器官移植 类风湿性关节炎，非何杰金氏淋巴瘤 革兰氏阳性菌感染 严重炎症，类风湿性关节炎
3．确定基因在的位置和拷贝数：染色体中定位多 用原位杂交法，拷贝数可用Southern杂交法确定。
4．基因表达谱分析：该基因在不同组织、细胞的表 达状态。Northern blotting和点阵杂交检测mRNA的 水平。Western blotting检测蛋白质的表达。
5．基因表达产物的功能分析： （1）找已知功能的同源蛋白或同源结构域。
不同组织甚或至于同一组织的蛋白质与mRNA 的“正常”差异很难与特异性差异区别。
（二）定位克隆（positional cloning）
——从一种致病基因的染色体定位出发，逐步缩小 范围，最后克隆该基因 。系统的定位克隆包含：
遗传学分析： 包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基
因的染色体定位； 分子生物学分析：
一、疾病相关基因分析
要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的 方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分 析基因的结构和疾病状态下基因的突变。
1911年Wilson将红绿色盲基因首次定位到X染 色体上，开创了人类基因定位的先河。
1968年Donahue利用系谱分析将Duffy血型基因 定位于1号染色体上，这是人类首次将基因定位于常 染色体上。
通过基因的克隆，可获得具有特定生物学活性 的蛋白质。这尤其适用于那些来源特别有限的蛋白 质，或自然界本不存在的蛋白质。
克隆基因的表达可在大肠杆菌、枯草杆菌、酵 母、昆虫细胞、哺乳类细胞或整体动物体内。
基因工程产品比生物提取产品有明显的优势：
生物安全性： 未发现诸有如此类猪胰岛素、牛脑垂体提取的
生长激素、人血VIII因子的副作用。
活性的可控性： 基因工程产品的可重复性要好于生物提取物。
资源和生产成本： 无资源依赖性，生产成本也明显低于生物提取。
表7-1 临床正在使用或试用的部分基因工程产品
产品名称
乙型肝炎表面抗原 人胰岛素 生长激素 组织肝淳蛋白激活物（TPA） α-干扰素 β-干扰素 γ-干扰素 促红细胞生成素（EPO）* 粒细胞刺激因子（GSF） 粒细胞-巨噬细胞刺激因子（GMSF）* 表皮生长因子（EGF） 第VIII因子 第IX因子 白细胞介素2（IL-2） 白细胞介素3（IL-3） 白细胞介素4（IL-4） 干细胞生长因子（SCF） 抗CD3抗体 CAMPATH-1H（淋巴细胞抗体） 抗内毒素抗体 抗肿瘤坏死因子抗体
20世纪80年代以前，可进行结构分析的疾病相 关基因仅限于个别功能异常非常明确，基因表达产 物纯化较易的遗传性疾病，尤其是血液系统疾病如 镰刀状贫血、地中海贫血等。
20世纪80年代中期以后，随着分子生物学技术 的发展，尤其是重组DNA技术水平的提高和PCR技 术的广泛应用，使疾病相关基因的鉴定与克隆工作 得以迅速发展。
✓只要能获得部分氨基酸序列就可以进行基因克隆。
根据mRNA表达差异来克隆疾病相关基因：
（1）削减杂交(subtractive hybridization) 将正常与异常的同一组织的mRNA或cDNA文
库进行杂交，筛选出表达有差异的克隆；
（2）差异显示（differential display）PCR 能很灵敏地扩增两个mRNA样品中有差异的片
（一）功能性克隆(functional cloning)
——从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病 基因。实际上是利用纯化蛋白克隆致病基因。
获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种：
➢获取部分氨基酸序列，推导出mRNA序列，合成 寡核苷酸探针，筛选 cDNA ；从基因组 获取其基因组序列。
➢制备特异性抗体，筛选表达型cDNA。段，克隆后进行分析； （3）基于PCR的削减杂交法
将前两种方法结合起来，克服了削减杂交灵敏 度低，差异显示PCR假阳性高的缺点。
优点：
功能性克隆技术成熟、方法直接、费用较低， 迄今仍是克隆基因的首选策略。
缺点：
大多数症状的生理、生化变化很复杂，对与之 有关的蛋白质了解甚少，对其基因表达主要组织也 知之不多。