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核磁共振技术
• 核磁矩不为零的核在外磁场的作用下，核自旋能级发 生塞曼分裂，共振吸收某一特定频率的射频（RF）辐射， 这一物理过程就是核磁共振。
满足共振条件可以有两种方法
• 一是固定电磁波的频率而逐渐改变外加磁场，称为扫场 • 另一种是固定磁场而改变电磁波的频率，称为扫频。 • 目前应用最广的是脉冲傅立叶变换的核磁共振技术。即应用一个短时
• 例如用AFM纳米嫁接的方法， 在添加了三氟乙醇的缓冲溶液中， 将铁硫金属蛋白修饰到已经组装 了硫醇的金电极上（如图）， 图中可以明显的看出最高的蛋白 质分子，次高的硫醇自组装膜区 域以及金基底。
纳米嫁接的蛋白质AFM三维形貌图
交联质谱技术（CXMS）
• 核磁共振技术、X射线晶体衍射技术等，对于蛋白质的 纯度、结晶性和绝对量均有比较高的要求，限制了其广泛 应用，交联质谱技术是近十年来发展起来的新技术，它将 质谱技术与交联技术相结合，在研究蛋白质结构与相互作 用方面具有速度快、成本小、蛋白质各方面性状要求低等 优势。 • CXMS原理：利用化学交联剂（通常包含两个反应基团和 一个连接区域）处理蛋白质样品，将空间距离足够接近、 可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后 利用基于质谱技术的蛋白质组学手段分析交联产物。
X-衍射技术在蛋白质研究中的应用
• 英国生物化学家肯德鲁（John Cowdery Kendrew）和佩 鲁兹（Max Ferdinand Perutz），用X-射线衍射分析法研 究血红蛋白和肌红蛋白，而且共同研究X-射线衍射晶体照 相术，以及蛋白质和核酸的结构与功能。 • 1960年，他们把一些蛋白质分子和衍射X-射线效率特别 高的大质量原子（如金或汞的原子）结合起来，首次精确 地测定了蛋白质晶体的结构。肯德鲁和佩鲁茨分享了1962 年的诺贝尔化学奖。
• 一维核磁共振是在一个脉冲之后的t1时间进行数据收集
• 二维核磁共振在t1时间后再加一个脉冲后在t2时间内收集 数据S（t1，t2），然后分别以t2和t1为变量进行傅立叶变 换就得到二维谱S（w1，w2）。二维谱就是把作为对角线 的一维谱的峰进一步分开。
核磁共振应用于测定蛋白质三维结构
• 950年，Proctor等人研究发现：质子的共振频率与其结构 （化学环境）有关。在高分辨率下，吸收峰产生化学位移 和裂分，由有机化合物的核磁共振图，可获得质子所处化 学环境的信息，进一步确定化合物结构 • 1971 年，比利时科学家J. Jeener 提出二维核磁共振的概念 • 1985年，Kurt Wü thrich在此基础上发明了一种新的方法， 他选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象，连 续测定所有相邻的两个质子之间的距离和方位，这些数据 经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图
• 2.紫外共振拉曼光谱和二维相关红外光谱 共振拉曼光谱是在吸收区选择激发样品，在紫外区选择激 发蛋白质分子的不同区域，开展蛋白质结构的研究工作，很 大程度地提高了拉曼散射截面，排除了荧光干扰，使光谱的 信噪比显著提高。 二维相关红外光谱作为一种新的分析技术被用来分析蛋白 质的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带。此技术非常有用，因为二维相关红 外光谱能够按不同的二级结构将酰胺带去卷积成各成分带； 能够给予一个扰动，通过选择性的相关峰，将不同的二级结 构关联；能够提供各种环境下，二级结构变化和氨基酸残基 变化的特有规律。
• 相对于其他两种成熟的结构生物学研究手段——X射线晶 体学和核磁共振技术,主要有以下一些优势： • 1）可以直接获得分子的形貌信息，即使在较低分辨率下， 电子显微学也可给出有意义的结构信息； • 2）适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术 进行分析的样品，如难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等； • 3）适于捕捉动态结构变化信息； • 4）易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结 构信息； • 5）电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射 线晶体学直接和方便。
• 三维电镜重构技术的缺点： 由于生物样品易受辐照损伤、图像衬度低、信噪比低的 特点，它对生物大分子的高分辨率结构解析非常困难。
蟑螂浓核病毒通过冷冻电子显微镜技术进行的病毒 衣壳空间结构的三维重构分析
蛋白质溶液构象的光谱技术
• 1.同步辐射圆二色光谱（SRCD）研究蛋白质结构 采用同步辐射光源，可以将测定波长低至160nm，从而 提供低波长的信息。而且，SRCD的真空紫外辐射不破坏蛋 白质短的整体性，并且有高的信噪比，更快的测量等特点， 在高浓度缓冲液和其它吸附成分存在时仍可以完成样品的检 测。
扫描探针显微镜（SPM）技术
• SPM家族通常分为扫描隧道显微镜（STM）和原子力显 微镜(AFM)两大类。其成像及工作原理分别是检测针尖和 样品之间的隧穿电流和相互作用力。 • SPM具有很高的空间分辨率，可以原位实时成像，并且可 以在一定条件下成原子级像。蛋白质分子由于必须依靠一 定的媒介环境才能保持其生物活性和化学活性，因而蛋白 质的成像通常是在特定的缓冲液中
X-衍射技术在蛋白质研究中的应用
• 莱纳斯.鲍林（Linus Carl Pauling）将X-射线衍射晶体结 构测试的方法引入到蛋白质结构测定中，并且推导了经衍 射图谱计算蛋白质中重原子坐标的公式。至今，通过蛋白 质结晶进行X-射线衍射实验仍然是测定蛋白质三级结构的 主要方法，人类已知结构的绝大部分蛋白质都是经由这种 方法测定获得的。 • 结合血红蛋白的晶体衍射图谱，鲍林提出蛋白质中的肽 链在空间中是呈螺旋形排列的，这是最早的α螺旋结构模 型。
• 3）电子密度图的计算和解释 有了每个衍射点的相位，加上已经收集到的每个衍射点的 结构振幅，就可计算电子密度图。由于蛋白质分子结构的 复杂性，它的电子密度图随着分辨率的不同，从图上能识 别出的结构层次也不同。
• 4）结构模型修正 从电子密度图上最初建立的蛋白质分子结构模型是比 较粗糙的，需要进一步精华。
• 1）晶体培养。 结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以 获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的 关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的瓶颈。
• 2）数据收集和处理 一般来讲，中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少要收 集几万个衍射强度数据，再经过专门的数据处理程序包处 理，给出这一套数据的各种统计结果，以判断数据质量的 好坏。
• 核磁共振技术的优点： 具有高分辨率，仅次于 X- 射线晶体学技术， 可以在溶液中操作，在 近似蛋白质生理环境下 测定其结构，甚至可以 对活细胞中的蛋白质进 行分析，获得“活”的 蛋白质结构。
缺点：所能测定的样品的分子量要比较小， 一般在50KD以下。另外核磁共振衍射技 术的反应体系是溶液，这对不溶的蛋白比 较困难，如膜蛋白，只有用去垢剂才能溶 解，这就使研究复杂化。在核磁共振衍射 的观察中，去垢剂会造成很大的噪音和假 相。实验周期较长，采用核磁共振方法寻 找蛋白质结构较为耗费人力及时间，尤其 是图谱分析工作极为困难和费时。
间方波脉冲激发样品，这种方波中包含各种不同的频率在内，因此样
品中不同的核可在同一时间内都得到激发。但是脉冲过后得到的是指 数衰减的时域函数，借助Fourier变换的数学方法把时域函数转换成频
域函数，这时就能见到已经产生的若干共振峰，这种变化过程可以由
计算机自动完成。
• 一维核磁共振只能测定小分子的结构如氨基酸，要测定大 分子物质就需要利三维电镜重构技术
• 在电镜下观察生物大分子时，观察的对象是三维结构，电 镜图像是这些三维结构的二维投影。由生物结构的二维电 镜图像推知其三维结构的方法称为三维电镜方法
• 三维电镜技术的新进展：冷冻电子显微镜技术 冷冻电镜三维重构是结构生物学研究中的一种较新的技 术。它的基本技术路线为：利用快速冷冻技术对样品进行 冷冻固定，然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进 行电子成像，利用高灵敏底片进行成像记录，利用高分辨 率扫描仪对底片进行数字化，对数字化的图像进行二维图 像分析——选点、分类、校正和平均，最后完成样品的三 维重构计算。
蛋白质结构的研究技术
小组成员：王鹏、任楠楠、陈瑶、占希、宫婷 婷 主讲人：xx
蛋白质结构的研究技术
• 1.X射线单晶衍射分析技术 • 2.核磁共振技术 • 3.蛋白质的二维结晶及三维重构技术 • 4.蛋白质溶液构象的光谱技术 • 5.扫描探针显微镜技术 • 6.交联质谱技术 • 7.分子模拟技术
X射线单晶衍射技术的原理
分子模拟技术
• 分子模拟技术是以计算机技 术为依托，以量子化学、统计 力学为理论基础。它为蛋白质 的结构预测和功能测定提供了 一种崭新的手段。
分子模拟技术的工作流程图
X-衍射技术在蛋白质研究中的应用
• 2000年，美国科学家阿格雷（Peter Agre）与其他研究人 员应用场发射电子源的电子衍射方法得到分辨率为3.8埃 的AQPl 水通道电子密度图，发现了一种被称为水通道蛋 白的细胞膜蛋白就是人们寻找已久的水通道，并公布了世 界第一张水通道蛋白的高清晰度立体照片。 阿格雷和麦金农因为对膜蛋白分子和离子通道开创性的 研究，而共同分享了2003 年的诺贝尔化学奖。
当一束X射线照射到晶体上时，X射线在晶体中产生衍 射现象。晶体所产生的衍射花样都反映出晶体内部的原子 分布规律。
X-衍射技术的原理
• 若用照相法收集衍射线，则可使胶片感光，留下相应 的衍射花样(衍射光斑、衍射光环或衍射线条) 。
• X射线晶体衍射分析（X－ray Crystallography）主要包 括以下五个步骤： 1）晶体培养 2）数据收集和处理 3）测定相位 4）电子密度图的计算和解释 5）结构模型修正