凝胶过滤的注意事项
1. 要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过 要根据待分离物质的分子量， 滤基质； 滤基质； 2. 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离， 可用于疏水性分子的分离， 可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分 离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析” 离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”； 3. 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 4. 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％； 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1 上样量一般在柱床体积的 5. 凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过 凝胶过滤的样品浓度越大越好， 样品浓度越大越好 100mg/ml。 100mg/ml。
Ion-Exchange chromatography
+ +
If pH mobile phase =7.2 Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)
+ + + +
+ + +
-
+ + +
+ + + + + + +
-
+
Anion exchange column = + charged
1- the strength with which these ions are held to the NTA resin
NTA has a tetradentate chelating group that occupies four of six sites in the nickel coordination sphere
蛋白质的分离纯化 与定性定量分析
什么是蛋白质的分离纯化
分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。 分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。 纯化：得到单一蛋白的纯品。 纯化：得到单一蛋白的纯品。
为什么要纯化蛋白质？ 为什么要纯化蛋白质？
研究特定蛋白质的生物学功能（ 研究特定蛋白质的生物学功能（酶、生物活性 蛋白，etc） 蛋白，etc） 制备抗体 蛋白质晶体学研究 研究蛋白质研究蛋白质-蛋白质相互作用
怎样纯化蛋白质？ 怎样纯化蛋白质？
生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 来分离或纯化它。 异，来分离或纯化它。 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质…… 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
可溶性：硫酸铵沉淀 可溶性： 等电点：离子交换层析 等电点： 分子大小：凝胶过滤层析 分子大小： 生物学性质：亲和层析 生物学性质：
Size-exclusion chromatography
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.
蛋白质纯化的基本设计原则
原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； 原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素， 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素， 特异性的蛋白质检测方法 决定了纯化能否成功）； 决定了纯化能否成功） 分级分离，先粗后细； 分级分离，先粗后细； 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。
Affinity chromatography
Makes use of specific binding interactions between molecules 1- Incubate crude sample with the immobilized ligand
3- Elute
2- Wash away non bound sample components from solid support
2- the specificity of the interaction between histidine residues and immobilized nickel ions
基因工程中 亲和层析是基因工程 最常用的纯化技术 亲和层析是基因工程中最常用的纯化技术
在各种表达载体上都带有各种标签蛋白 在各种表达载体上都带有各种标签蛋白，如 标签蛋白， GST-tag、His-tag、V5-tag等 GST-tag、His-tag、V5-tag等，它们不仅可用于 鉴定蛋白表达与否，更可用于与之相连的目标蛋 鉴定蛋白表达与否， 白的纯化； 白的纯化； 通过免疫亲和层析技术，只需一步， 通过免疫亲和层析技术，只需一步，即可纯化带 有标签的目标蛋白。 有标签的目标蛋白。
怎样纯化蛋白质？ 怎样纯化蛋白质？
生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 来分离或纯化它。 异，来分离或纯化它。 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质…… 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
可溶性：硫酸铵沉淀 可溶性： 等电点：离子交换层析 等电点： 分子大小：凝胶过滤层析 分子大小： 生物学性质：亲和层析 生物学性质：
Ion-Exchange chromatography
+ +
+
-
+ -
+ + + +
+
+ + +
Cl-
Cl- +
Cl-
+
+ Cl+ Cl-
+
Na+ Na+ Na+ -
Na+Na+
Na+ Na+ Na+ Na+
+
Cl-
+
Increased salt concentration
分步洗脱
梯度洗脱
2. 凝胶过滤层析
Affinity chromatography
Commonly used affinity columns:
Ni2+ binds to poly Histines (example 6xHis) Specific antibodies (anti-Flag tag) glutathione binds to GST Protein A or G binds antibodies
3. 亲和层析
以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的 样品的生物活性为依据的分离方法。 为依据的分离方法 特点是有专一的活性，如酶与底物的结合， 特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与 抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。 抗体，激素与受体，糖与凝集素……等 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固 定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。 定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
Affinity chromatography
Possible elution strategies:
pH Ion strengh Denature Competitor ligand or analog
Ni-NTA columns
The high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged proteins or peptides is due to:
1. 离子交换层析
离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（离子 离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（ 交换剂） 交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的 目的，属于吸附层析。 目的，属于吸附层析。 离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质 离子交换层析的固定相称为离子交换剂， 基团两部分组成 两部分组成。 和基团两部分组成。 ① 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯乙烯苯等高分子聚合物； 乙烯苯等高分子聚合物； ② 基团：共价结合在基质上的带电基团，可分 基团：共价结合在基质上的带电基团， 正电基团和负电基团。 为正电基团和负电基团。
相对离心力/ 相对离心力/×g 1 000 4 000 15 000 30 000 100 000
时间/min 时间/min 5 10 20 30 3～10 h
沉降的组分 真核细胞 叶绿体、细胞碎片、 叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞 溶酶体、 碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation） 粗分级分离（ fractionation） 获得蛋白质提取液后，用一定方法， 获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与 其它杂蛋白分离开来。 其它杂蛋白分离开来。 常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分 常用方法：盐析、等电点沉淀、 离等 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（ 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包 括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。 括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液 ），又能浓缩蛋白质溶液。
chrome意为“色彩” graphy源自希腊文 chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为 源自希腊文， 意为 “写”。“层析”就是“色谱” 。 层析”就是“色谱” 层析最早由俄国植物学家 Цвет 于1903年创造， 1903年创造 年创造， 1941年英国学者 1941年英国学者Martin和Synge提出分配层析， 年英国学者Martin和Synge提出分配层析 提出分配层析， 此后这种方法得到很大的发展。 此后这种方法得到很大的发展。 层析是利用物质在固定相 流动相之间不同的分 层析是利用物质在固定相与流动相之间不同的分 固定相与 配比例，达到分离目的的技术。 配比例，达到分离目的的技术。