第五节 理化鉴定
理化鉴定(pΒιβλιοθήκη ysical and chemical identification)：
利用某些物理的、化学的或仪器 分析方法，对生药及其制剂中所 含有效成分或主要成分进行定性 和定量分析，以鉴定其真伪和品 质优劣程度的一种方法。
理化鉴定
中药理化鉴定发展很快，新的分析 手段和方法不断出现。 可确定中药的真伪优劣； 开发利用新资源； 指导中药材的栽培加工，扩大药
1．在植物进化、分类、鉴定中的应 用
应用分子遗传标记技术来研究种 间、属间的DNA变异情况，从而揭 示物种的亲缘关系，为物种鉴定 及系统学研究提供依据。
采用RAPD分子标记方法比较4种甘 草属植物光果甘草、乌拉尔甘草、 刺甘草和刺果甘草的遗传关系。
通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析， 结果发现富含甘草甜素的光果甘 草和乌拉尔甘草之间遗传关系非 常相近。
一、DNA遗传标记技术的方法及 原理
1、限制性内切酶酶切片段长度多态 性(RFLP，restriction fragment length polymorphism)
其基本原理是物种的基因组DNA在 限制性内切酶的作用下，在特定 的核苷酸顺序上切割，产生相当 多的大小不等的DNA片段；
用放射性同位素标记的DNA探针检 测与被标记DNA相关的片段，构建 多态性图谱。
用RAPD方法对人参、三七及4种人 参伪品的DNA进行PCR扩增，所得 DNA指纹图谱可用于区别人参属的 3种生药及伪品。
3．在道地生药鉴定中的应用
一个物种的种内多样性是道地药 材品质形成的生物学基础。
道地生药与非道地生药的本质区 别是作用物质基础有效成分的差 异，其形成主要受遗传因子和环 境因子的影响。
用部分； 制订中药质量标准。
常用的理化鉴定方法
物理常数 包括相对密度、旋光度、折光率、 硬度、黏稠度、沸点、熔点等。
一般理化鉴别 呈色反应：
利用生药的某些化学成分能与 某些试剂产生特殊的颜色反应 来鉴别。
多在试管中进行，或在生药切面 或粉末上滴加各种试液，观察呈 现的颜色以了解某成分所存在的 部位。
该方法试验步骤繁琐(包括 southern转移、探针标记、杂交、 检测等)，又受到探针来源的限制， 所需DNA样品量大。
2．聚合酶链式反应(PCR， Polymorase chain reaction)
PCR技术是20世纪80年代中期发明 的一种模拟体内DNA复制过程的体 外酶促合成特异性核酸片段技术， 又称无细胞分子克隆技术。
该方法操作简便、快速、特异、 灵敏，不需提纯，不需使用同位 素、省去了基因克隆步骤、对植 物材料要求不严、用量少；
但该技术所需的一对引物设计， 需要知道物种的遗传信息，因而 在生药研究中具有一定的局限性。
3、随机扩增多态性DNA(RAPD， random amplified polymorphic DNA)和任意引物PCR(APPCR)
将生药的干粉、切片或浸出液少 量，置于载玻片上，滴加某些化 学试液，使产生沉淀或结晶，在 显微镜下观察反应结果；或观察 所产生的特殊颜色。
荧光分析
利用生药中所含的某些化学成分， 在紫外光或自然光下能产生一定 颜色的荧光性质进行鉴别。
例如
黄连饮片显黄色荧光；
浙贝母粉末显亮淡绿色荧光；
大黄粉末显深棕色荧光。
AP-PCR技术是用20-30个碱基的任 意引物，以未知序列的基因组DNA 为模板，进行PCR扩增。
4．DNA测序方法(DNASequencing)
基于PCR的DNA直接测序技术以PCR 扩增引物作为测序引物，使DNA分 子鉴定技术取得了突破性进展。
二、DNA分子遗传标记在生药鉴 定中的应用
色谱法
常用以下三种色谱法： 薄层色谱法(TLC) 气相色谱法(GC) 高效液相色谱法(HPLC)
分光光度法
紫外分光光度法 可见分光光度法 红外分光光谱法 原子吸收分光光度法
第六节 DNA分子标记鉴定
DNA分子遗传标记技术直接分析生物 的基因型，具有下列特点： 遗传稳定性 遗传多样性 化学稳定性
沉淀反应：
利用生药某些化学成分能与某些 试剂产生特殊的沉淀反应来鉴别。
泡沫反应和溶血指数的测定
微量升华
利用中药中所含的某些化学成分， 在一定温度下能升华的性质，获 得升华物，在显微镜下观察其结 晶形状、颜色及化学反应作为鉴 别特征。
显微化学反应(microchemical reaction)
这两者与不含甘草甜素或含量极 低的刺甘草和刺果甘草的遗传关 系则较远，与植物分类学研究相 吻合。
2．在中药材鉴别中的应用
通常PCR扩增的模板DNA都来自新 鲜的动植物组织材料，因DNA分子 遗传标记方法用于生药鉴别中， 首先要解决的问题是能否从干的 或陈旧的生药样品中提得生药本 身的DNA，并能用于PCR扩增，这 方面已有成功的报道。
这两种技术是在90年代初几乎同 时发明的。
其主要优点是适于未知序列的基 因组DNA的检测。
RAPD技术的基本原理是采用合成 的较短的单个随机引物(10核苷 酸)，利用生药总DNA为模板，在 DNA聚合酶的作用下，进行非特异 性的PCR扩增反应，可获得一组不 连续的DNA片段，分析扩增产物电 泳图谱在不同类群中的变异。
应用DNA遗传标记技术，比较道地 生药与非道地生药的基因差异， 将有助于阐明道地生药的成因。