基因工程实验流程实验一丹参总DNA的提取实验目的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的方法。

实验材料：丹参叶片实验器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，研钵和杵，离心管，微量移液器，枪头实验步骤：第一次使用前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度2%。

1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或干重组织30 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。

2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (确认已加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解。

如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。

3.65℃水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

可选如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。

如RNA残留多，可在水浴前加入6μlRNA酶（20mg/ml）。

4.加入700μl氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离心5分钟。

若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。

5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。

如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。

6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。

此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。

7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - 入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。

8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。

9.加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

10.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

11.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟12,000rpm 离心1分钟。

将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

13.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20 ℃。

按照植物总DNA提取试剂盒操作说明。

1%琼脂糖凝胶电泳检测注意事项：1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm 的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。

3.需要自备氯仿/异戊醇（体积比24：1混合）、无水乙醇和β-巯基乙醇。

4.结合液PQ 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。

若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.不同来源的植物组织材料中提取DNA的量会有差异，一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg。

6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。

也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。

用水洗脱DNA应该保存在－20℃。

实验结果：本组实验结果是第九孔和第十孔，其中第九孔的DNA 提取效果较第十孔提取效果好。

两空之间的差异可能是由于两个离心管中添加的植物量不一样，所以最后提取的量不一样。

实验结果分析：1.在液氮研磨叶片的时候，研磨不够充分，且在向离心管中添加的时候，添加的量不多，速度慢，导致氧化，对提取效率造成很大影响。

2.可能是因为在提取DNA的最后步骤向吸附管中添加的洗脱液太多150ul，导致DNA的浓度过低，所以条带不亮。

3.在第九步中，将吸附柱放置室温晾干，可能晾置时间不足，导致添加的有机溶剂没有完全挥发，而有机溶剂影响了DNA的提取。

实验二质粒DNA的提取及酶切检测实验目的：学习和掌握小量提取质粒的方法。

实验原理：质粒提取（碱裂解法）根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH12.0-12.6的碱性条件下，线性的染色体DNA变性，双螺旋解开，而共价闭环质粒DNA仍保持双链紧密缠绕的状态。

将pH 调至中性并保持高盐浓度的条件下，染色体DNA之间形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，而共价闭环质粒DNA保持可溶状态，经离心可将大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质除去，质粒DNA留在上清液中，用酚、氯仿抽提，可进一步纯化质粒DNA。

实验材料：含有pET28a质粒的大肠杆菌H5а；构建好的含有目的基因SRP的pET28a-SRP质粒的大肠杆菌DH5а实验器材：离心机、水浴锅、电泳仪、离心管，微量移液器，枪头，等实验步骤：质粒提取按照试剂盒操作说明。

1．用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。

12,000rpm离心1min，弃上清。

应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。

菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。

菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。

2．250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。

室温静置1-2min。

初次使用本试剂盒时，请将RNaseA全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。

可保存6个月。

●不要残留细小菌块。

菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。

●室温静置1-2min是为使溶液中的RNA被充分降解。

3．加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀6-10次。

室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。

●若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。

待恢复至室温后使用。

沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。

●不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。

●此步骤不宜超过5min。

4．加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。

此时会出现白色絮状沉淀。

5.12,000rpm室温离心10min，收集上清。

6．将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。

●如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（800μl），可将上清分次加入DNA纯化柱中。

7.12,000rpm离心1min，弃滤液。

●此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。

8．加入500μl溶液PB/PE（去蛋白液），12,000rpm离心1min，弃滤液。

●此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。

9．加入500μl溶液WB，12,000rpm离心1min，弃滤液。

●溶液W初次使用前用无水乙醇按1:1.5稀释，即含60%乙醇。

10．加入500μl溶液W，12,000rpm离心1min，弃滤液。

11.12,000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

12．将DNA纯化柱置于新的离心管中。

向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液Eluent，室温放置2min。

●12,000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。

质粒DNA 于-20℃保存●溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。

溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

酶切反应体系：载体pET28a-SRP 30ulXho I 1ulHind III 1 ul双酶切buffer 5 ul超纯H2O 13ul37度，3小时。

电泳检测分析注意事项;1.使用前往准备好的solution中加入RNaseA；2．浓缩的wash buffer用乙醇稀释；3．所有步骤都在室温下操作。

实验结果：实验结果分析实验三目的基因的克隆[实验目的]通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

[实验原理]多聚酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。

在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1，变性：加热使模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5，+3，方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。

[仪器、材料与试剂] ·(一)仪器1．PCR热循环仪2．琼脂糖凝胶电泳系统 3. 吸头、0.2ul PCR管，微量移液器，(二)材料：质粒(三)试剂1．2×PCR Master Mix (含dNTP，Tag酶，缓冲液)2．质粒DNA3．引物（上、下游引物浓度均为约10umol/ul）F:5-CCC AAGCTT CTTTTTAATCCTTCCCTCAAATATC-3（Hind III）R: 5-CCG CTCGAG GGGACAATGAAAAAGCTGATAAC-3 (Xho I) 4．灭过菌的millipore 水5．琼脂糖6．DNA相对分子质量标准物DL2000[实验方法]1．学习PCR仪的使用，设定反应程序：反应程序为：94℃变性3 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1min20s，30个循环；72℃延伸8 min。

4℃保存2．加样（冰上操作）：50ul反应体系，其中上游引物1ul，下游引物1ul，丹参DNA 模板2 ul或质粒DNA模板1ul，2×PCR Master Mix 25ul, 灭菌水21或22ul。