《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。
该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内3. 3.2pMD18-T载体pMD18-T载体是线状DNA，2.7kb，3’端有oligo(dT)，可插入PCR扩增产物。
插入位点两侧有常用的限制性内切酶酶切位点和T7、SP6 RNA聚合酶转录起始位点。
带有氨苄青霉素抗性基因，见图2。
图2 含有氨苄青霉素抗性的pMD18-T载体3. 4 试剂盒质粒小量抽提试剂盒购自安比奥生物技术公司；琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒购自北京TIANGEN公司；无内毒素质粒大量抽提试剂盒购自北京TIANGEN公司；DNA Ligation Kit Ver.2购自大连TaKaRa生物公司。
3. 5 其他试剂琼脂糖粉（Agar A）购自上海Yito公司；氯化钠、异丙醇和丙三醇购自长沙分路口塑料化工厂；无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂；胰蛋白胨（Trytone）、酵母提取物（Yeast Extract）、琼脂糖（Agar M）购自加拿大BBI公司；EB染液购自深圳市达科生物技术有限公司。
3. 6 DNA分子量MarkerDNA ladder mix #SM0331（深圳晶美公司）DNA ladder 100 bp #SM0321（深圳晶美公司）DNA ladder 100 bp #SM0241（深圳晶美公司）3.7 PCR引物CMLC2 启动子上游引物（CMLC2-L），下游引物（CMLC2-R）序列如下：CMLC2-L：5’-GAATTCAATGAGCTCTCCAAATCAGCAG-3’(划线部分为Eco R I酶切位点)CMLC2-R：5’-GGATCCGAGGAAACCGATTGCTACAAACC-3’(划线部分为Bam H I酶切位点)3.8主要仪器PCR仪，低温高速台式离心机，fresco离心机，SHINADZU电子天平，超净工作台，ZF-90型暗箱式紫外透射仪，DYY-III 8B型稳压稳流电泳仪，微波炉，XK96-A快速混匀器，GBII240-89不锈钢电热恒温水浴锅，电热恒温鼓风干燥箱，HX-1050恒温循环器，隔水式电热恒温培养箱，GIS-1000数码凝胶图象分析系统，6031-000-012核酸蛋白定量仪（Biophotometer），超纯水仪，紫外分光光度计，立式压力蒸汽灭菌器，恒温摇床，SCOTSMAN 制冰机，荧光显微镜，37℃细胞培养箱。
四、基本方法4.1转化实验4.1.1大肠杆菌感受态的制备（1）从-80℃冰箱中将E.coli DH5α菌种取出解冻，用未加抗生素的LB培养皿划线，37℃培养过夜；（2）挑取单个菌落入3ml LB（未加抗生素）液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养过夜；（3）取过夜菌液0.5ml接种于50mlLB培养液中，37℃剧烈振荡培养2-3h；（4）冰浴10min，然后4℃、5,000rpm离心5min；（5）弃上清，加25ml预冷的100 mmol/L CaCl2，悬浮菌体；（6）冰浴30min，然后4℃、5,000rpm离心5min；（7）弃上清，加3.3ml预冷的100 mmol/L CaCl2，悬浮菌体；（8）4℃放置12h后加入终浓度为15%的无菌甘油，按70μl分装，-80℃保存备用。
4.1.2 培养基的配制液体培养基：Trytone 5g，NaCl 5g，Yeast Extract 2.5g，加水至500ml。
固体培养基：Agar A 7.5g，Trytone 5g，NaCl 5g，Yeast Extract 2.5g，加水至500ml。
4.1.3 转化步骤（1）将感受态细胞置于冰上，将一半体积的连接子加入感受态细胞，混匀，冰上放置30min，另一半连接子-20℃保存备用；（2）42℃水浴60-90s热休克；（3）迅速冰上冷却3-5min；（4）加入1ml液体LB（不含抗生素），37℃摇床培养1h；3,000rpm离心2min；（5）吸去上清700μl，剩余300μl混匀，一半用于涂板，另一半4℃储存备用；（6）150μl菌液涂布于含Kana（25μg/ml）或Amp（50μg/ml）的固体LB平板表面（平板已预热），37℃正置培养30min，倒置培养过夜。
4.1.4阳性克隆的筛选与鉴定用无菌吸头挑单个菌落至含抗生素的液体培养基中，200r/min，37℃振荡培养过夜。
PCR初步检测阳性克隆后，提取质粒DNA进行双酶切鉴定。
4.2 质粒DNA的小量抽提按安比奥公司质粒DNA小量抽提试剂盒操作手册进行：（1）大肠杆菌的培养：从平板上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养；（2）取1-4.5ml的过夜培养菌液，10,000rpm离心1min收集菌液于1.5mlEP管内；（3）将细菌重悬于250μl Buffer PB1（已加入附赠的RN ase）,涡旋震荡，使细菌充分分散;（4）加入250μl Buffer PB2，轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液，一般反应时间不要超过5min；（5）加入350μl Buffer NB3，轻轻地上下翻转混合5-6次，直至形成絮状沉淀，然后室温静置3-5min；（6）14,000rpm离心10min，将上清转移到含收集管的离心柱内，12,000rpm离心1min，倒去收集管内的废液，并将离心柱重新放入收集管内;（7）加入500μl Buffer PB4于离心柱内，12,000rpm离心1min，倒去收集管内的废液，并将离心柱重新放入收集管内;（8）向离心柱内加入750μl Buffer WB(已加无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒去收集管内的废液，将离心柱放入收集管内;（9）重复步骤（8）一次;（10）13,000rpm空离心2min；（11）将离心柱置于干净的1.5mlEP管上，向滤膜中央滴加50μl的超纯水或洗脱液Buffer EB，室温静置2-3min；（12）12,000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存。
4.3 质粒DNA的大量抽提使用TIANGEN无内毒素质粒大量抽提试剂盒，步骤如下：（1）从小量制备并经酶切检验正确的菌种中挑菌，接种到含有抗生素的液体LB培养基中，37℃摇床培养过夜；（2）菌液加至50ml离心管，4,000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；（3）加入2ml溶液I，70μl RN ase；（4）加入2ml溶液II，温和混匀，冰上静置2min；（5）加入8.6ml溶液III，温和混匀，室温放置2min；（6）转入50ml离心管中，12,000rpm离心12min，将上清液移入放置在50ml离心管上的回收柱内（注意勿吸沉淀），室温静置5min后，4,000rpm 离心2min，弃离心管中废液，再离心2min，弃废液；（7）在回收柱中加入5ml Wash Solution，4,000rpm离心2min，弃废液，重复一次；（8）4,000rpm离心2min；（9）将回收柱放在一个新的50ml离心管中，在回收柱中加入500μl Elution Buffer（预先在56℃加热以提高回收效率，且分两次加入，第一次加入300μl，离心后收集液体，再加入200μl收集液体），静置2min后，4,000rpm离心2min，回收目的质粒。
4.4小量胶回收DNA3.4.1 试剂配制TAE缓冲电泳工作液：40mmol/L Tris.Ac，2mmol/L EDTA。
1%琼脂糖电泳胶：0.5g琼脂糖，50ml H2O，1ml 50×TAE缓冲液，2μl EB溶液。
电泳缓冲液：8ml 50×TAE，加水至400ml。
4.4.2 纯化步骤按TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒操作手册进行:（1）取质粒大酶切产物点样，75V电泳，跑胶90min；（2）在暗箱式紫外透射仪内切下含目的片段的胶装入已事先称重的1.5mlEP管中，并称重，注意每管胶不可超过0.4g；（3）加入胶的3倍体积的溶胶液PB(即0.1g的胶加入300μl的溶胶液)；（4）置于50℃恒温水浴数分钟，每几分钟混匀一次，以保证胶完全融化；（5）胶完全融化后将溶胶液冷至室温，再移入含收集管的回收柱，12,000rpm离心1min，倒去收集管中的废液；（6）加入700μl Wash Buffer (已加无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒去收集管中的废液；（7）加入500μl Wash Buffer (已加无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒去收集管中的废液；（8）13,000rpm空离心2min，尽量除去废液;（9）将回收柱室温放置数分钟，干燥;（10）将回收柱放入干净的1.5mlEP管中，向回收柱滤膜中央加入已预热（65℃-70℃最适宜）的Elution Buffer 30μl，室温放置2min；（11）12,000rpm离心1min，洗脱DNA；将洗脱的溶液重新加入回收柱，12,000rpm离心1min，以提高洗脱率。