生物毒性检测作业指导书
1.受试生物
受试生物的选择应遵循以下原则：
——栖息于非污染区、生长良好、健康无病的个体；
——对污染反应较敏感的种类；
——地理分布较广、数量较大，全年在某一实际海区容易采到的，并对其生活习性清楚，易在实验室条件下培养的种类；
——受试生物来源于同一地点、同一种群，力求个体大小基本一致；
——选用受试生物的早期发育阶段（受精卵、幼体）。

2.污染水样采集和致毒实验液的配制
2.1污染水样采集及处理
2.1.1采样应用无毒容器，水样应装满，以免运输过程剧烈摇荡而改变某些水质特性。

采集的水样量，应按实验设计和次数备足。

同一系列试验，应用同时同地采的污水。

2.1.2采水时应记录采样时间、地点，现场测量水温，并观察记录污染的表观现象。

2.1.3采回的水样最好立即用于实验，若需放置，应低温保存。

水样应进行化学分析，测定其盐度、PH、水温、溶解氧、化学耗氧量、营养盐及主要污染物含量，为配制致毒试液提供参考。

2.2致毒试液的配制
2.2.1毒性试验的浓度范围的确定一般应做预实验。

预实验可用较大浓度间隔按比级数配制污水稀释液，如：按污水体积比配制出如下浓度组：
0.01%、0.1%、1.0%、10%、100%。

2.2.2正式试验可根据预实验所提供的浓度范围，按相等的浓度对数间隔安排5个以上的试验浓度组。

2.2.3配制不同浓度的致毒试液时，应先将污水轻轻摇匀，再按需要量取一定体积用清洁海水稀释，注意yoga海盐或除氯自来水调节其盐度，使与受试生物的适盐范围基本一致。

2.2.4若要试验某特定污染物的毒性效应，可人工配制该种污染物的储备液，然后，参照化学分析测得的污水中该污染物的含量，酌情按上述方法，用洁净海水配制试液。

石油类污染物，可单独试验水溶性组分或用少量低毒性的分散剂制备乳浊液后再行配制。

3.试验步骤
a)备好若干洗净的试验容器，并按对照组和各不
同浓度组分别编号；
b）将上述配好的致毒试液，按浓度顺序分别倒入各相应的试验容器中，对照组可依试验目的，加入洁净的海水或受纳水体的海水；
c）按从低浓度至高浓度顺序，移入受试生物。

若受试生物是成体，每组放入10个以上；若受试生物属受精卵，密度约20000~30000个/L；若为贝类幼虫，密度10000~15000个/L；甲宙类无节幼体200~500只/L左右。

受试生物移入试液前，需经必要检查，受精卵、幼小个体应在解剖镜下观察，除去死亡和异常个体；
d）记录试验起始时间，检查时间是2h、4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h、32h、40h、48h、60h、72h、96h，发现死亡个体，应及时检出，统计记录
24h、48h、72h、96h各时间内的死亡或异常的总个体数。

受精卵和微小个体可用显微镜或解剖镜观察；
e）试验期间，每隔24h更换一次试液，注意勿改变各组试液浓度。

换新试液时，微小个体和受精卵可用孔径小于受试个体的筛子滤出，再放回相应的新试液中；
f）试验结束，为统计各组个体差异，应及时测量各组个体大小。

微小个体可进行显微测量若干数量，以比较各组生长发育受抑制情况。

必要时，还可取水样和受试生物样分析，比较试验前后污染物质在水体和生物体内的变化；
g）每一试验应有两个平行试验，并按上述步骤和条件，重复试验两次以上。

4.记录与计算
4.1按各致毒事件，把观察到的受试生物死亡或
异常的个体数记入表中，依据表中数据，计算死亡百分率。

由死亡百分率，查出对应的概率单位记入表中。

4.2半致死浓度的求法
概率单位法
求算某一试验事件的半致死浓度，可以死亡率的概率单位为纵坐标，试液浓度的对数为横坐标，在对数坐标纸上标出各数据点，拟合各数据数绘出一直线，在直线上查出概率单位为5的点所对应的浓度对数值，其反对数即为LC50.
由此法得出的lgLC50的95%可置信限，其计算如式（14）：
可置信限= lgLC50±1.96×2S/N2 (14)
式中：
S——表示标准差。

亦即相当于直线斜率的倒数。

数值等于概率单位6和4之差除其相应的浓度对数值之差；
N——死亡率在16%~84%范围内的各组受试生物总数。