甲型肝炎病毒--IgM检测ELISA法作业指导书
1.原理
本法是用抗人μ链捕获待测血清中特异性IgM，然后用HAV与特异性—IgM抗体反应，再加酶标记抗M 抗体，最后加底物显色。

2.标本采集
2.1采集前病人准备：受检者应空腹。

2.2标本种类：血清或血浆。

2.3标本要求：采集病人静脉血2ml（可用EDTA抗凝），室温放置不超过4小时，分离血清备用。

3.标本储存：2-8°C保存不应超过1周，-20°C不应超过3个月，-70°C长期保存，应避免反复冻融。

4.标本运输：密封，室温运输。

5.标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。

6.试剂
6.1 试剂名称：甲型肝炎病毒IgM抗体诊断试剂盒6.2 试剂生产厂家：厦门新创生物药业股份有限公司6.3 包装规格：96Test/Kit
6.4 试剂盒组成：
HAV-IgM酶联板1块96孔，，酶标试剂1瓶，阳性对照血清1管，阴性对照血清1管，20*浓缩洗涤液，底物A 1瓶，底物B 1瓶，终止液1瓶，封口膜1张，密封袋1套。

6.5 试剂储存条件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6个月。

7.仪器设备
7.1仪器名称：酶标仪
7.2仪器厂家：上海三科
7.3仪器型号：MC—318
8操作步骤
8.1平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25°C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

8.2配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

8.3编号：将微孔条固定于支架，按序编号每板应
设阴性对照3孔，阳性对照2孔，空白1孔。

8.4加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴，阳性对照50微升。

8.5温育（一）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温
育20分钟。

8.6洗涤（一）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

8.7加酶：除空白孔外，分别在每孔中加入酶标记
抗体100 l，轻拍混匀。

8.10 温育（二）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育40分钟。

8.11 洗涤（二）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

8.12 显色：每孔加入底物A、B各50μl，轻拍混匀，置37℃暗处15分钟。

8.13 终止：每孔加终止液50μl，混匀。

8.14 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。

9. 结果判断与分析
9.1 临界值（C.O.）的计算：临界值＝阴性对照孔OD 值N×2.1，阴性对照OD均值大于0.1时应重新试验，小于0.05时以0.05计算。

9.2 结果判定：样品OD值S/C.O>=1者为阳性
样品OD值S/C.O<1者为阴性
10. 质量控制：每次均应有阴阳对照，其OD值应在要求范围内。

11.参考值范围：阴性
12. 临床意义：血清中抗HAV-IgM在亚临床期即已出现，其滴度在感染后3个月维持在1000以上，已被公
认为早期诊断甲型肝炎的依据。

13. 操作性能：特异性强，灵敏度高，重复性好。

14. 方法局限性
15. 注意事项
15.1 每板建议设阴阳性对照血清各两孔，设空白对照时，不加样品及酶标记抗体，其余各步相同。

15.2 洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。

15.3 加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。

如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。

滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。

注意勿将试剂滴在孔壁上。

15.4 所有样品都应按传染源处理。

15.5 封口膜使用说明
15.5.1 微孔板拆封后，在取出当天所需的微孔条后，其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。

在封存时，注意勿把封口膜粘贴到微孔条底部，以免影响其透光性。

15.5.2 微孔板温育时，以封口膜覆盖孔口，可避免其他因素对实验带来的非预期的影响。

15.6不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。

16. 当检测系统（仪器）不能工作时，所采取的补救措施：应保证所有操作步骤正确无误；可以比对阴阳对照，肉眼判读；无法准确判读者，应留样待系统正常后复查。

17. 参考文献：中华人民共和国卫生部医政司编。

全国临床检验操作规程（第二版）410页。

18. 其它：必须按规定使用经中国药品生物制品检定所检定并贴有“检定合格”防伪标签的试剂。