优点：HCL本身加热可以蒸发除掉。
缺点：溶液显黒褐色、与含醛基化合物作用的结果。
提示：盐酸中的重金属，作为接触剂可使氨基酸遭受破 坏，故要求用高纯度的盐酸水解样品。
2、碱水解法：用2.5N氢氧化钠（氢氧化锂）作为水解
剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏 氨酸、精氨酸、胱氨酸遭到不同程度的破坏。(水解 时20小时）
专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性 阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树 脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂 是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树 脂的粒度一般在５～１０μｍ之间，交联度多为８ ％～１２％。
交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外 界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能 进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择 性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分 离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用 于蛋白质、肽类的分离。
氨基酸在溶液中受溶液pH的影响存在着下列平衡：
R CH COO-
NH2
H+
_ห้องสมุดไป่ตู้
OH -
R CH COO +N H 3
H+
OH- R C H C O O H
+NH3
pH>pI
pH=pI
pH＜pI
偶极离子--净电荷为零--在电场中不移动， 此时溶液的pH值称为等电点（pI）。
氨基酸等电点
丙氨酸 天冬酰胺 半胱氨酸 谷氨酰胺 组氨酸 赖氨酸 苯丙氨酸 丝氨酸 色氨酸 缬氨酸
氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年 的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解 氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨 基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各 行各业。它与其它分析仪器区别在于只能检测 氨基酸不能作为它用，具有专一性。从仪器的 配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分 离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应 系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法 （离子交换柱后茚三酮衍生方法）。
L-8900 AAA的分析原理
1、样品中的氨基酸在低PH的条件下都 带有正电荷,在阳离子交换树脂上均被 吸附,但吸附的程度不同,碱性氨基酸结 合力最强其次为中性氨基酸、酸性氨基 酸结合力最弱。 2、按照氨基酸分析仪设定的洗脱程 序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依 次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来， 3、分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高 温反应器中进行衍生反应，生成可以被 分光光度计检测的有色物质，然后在检 测器中被检测出来。
4.提高流动相PH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离 子交换柱上洗脱下来。洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨 基酸、碱性氨基酸。
5.氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺 序一定;标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定;由此 可计算出样品中各种氨基酸的含量。
离子交换树脂
氨基酸分析仪洗脱过程
1.氨基酸在PH2.2的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均 被吸附,但结合强度各不相同。
2.随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地吸附、解吸附。 由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）,吸附强度 有差异。
3.不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同：碱性氨基酸> 芳香 族氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸及羟基氨基酸。
L-8900 AAA的流程图
L-8900 AAA的性能指标
以蛋白水解液标准分析方法为例： 净分析时间：30分钟 检出限：3 pmol(信噪比=2，天门冬氨酸） 保留时间重现性：CV 0.3% （精氨酸） 峰面积重现性：CV 1.0% (甘氨酸、组氨酸）
氨基酸分析仪最大的特点：
（二）PITC法（异硫氰酸苯脂） （反应机理略） 此方法的重现性明显低于茚三酮法，最大
的缺点是：一个组分衍生后可生成2个以上的 衍生物，而且和其它组分峰重叠，灵敏度比较 低。由于有残留的衍生剂，柱效与柱寿命降低 很快（做200左右样品），变异系数在4%左 右，也偏大，个别氨基酸如组氨酸可达8%，某 些氨基酸在24小时内即降解。
参数 6种（试剂与清洗液） 4.6mm id x 60mm， 阳离子树脂填充（标配) 0.001-0.999ml/min, 0-20MPa, 2 1500µl; 200vial (200 cooler) ; 0.1-100µl 20-85℃（1℃）, 电子加热/制冷的温控装置。 50℃ --140℃,电子加热的温控系统 可见分光光度计（570，440nm） EZChrom Elite 分析软件 CPU: 32bits OS, Windows xp
微波消解技术：与传统的水解方法相比，有明显的优势。其原理是能量的 传递是通过分子的极化，而不是分子间的碰撞完成的，依赖水分子的高效 极化作用，样品可以快速吸收微波辐射的能量，微波技术还有一个重要的 特性，即能穿透一些介质，直接把能量辐射作用到反应物上，使之极性分 子每秒产生25亿次以上的分子旋转，迅速提高反应物的温度和反应速度， 从而得到样品快速的水解。
Ｒ ｜ Ｈ-Ｃ－ＣＯＯＨ ｜ ＮＨ２
组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即 а-碳原子。 а-碳原子有四个不同取代基：羧基、 氨基、氢原子和R基团，不同 氨基酸的R基团不同。 每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L-构型。 广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样等）。
10.76 2.98 3.22 5.97 5.98 5.75 6.30 6.53 5.65 6.02
（二）氨基酸的分类
按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类： 中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱 氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚 氨基酸类） 酸性氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸 碱性氨基酸：赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸
（一）OPA法（邻苯二甲醛）（反应机理略）
最大的不足之处是：做全分析时需配以其他技术一起使 用，方可与带有仲氨基团的氨基酸进行反应。赖氨酸及 胱氨酸衍生物荧光较弱，灵敏度低。因为OPA是快速反应 剂，有些氨基酸反应极其不稳定，特别是甘氨酸、赖氨 酸衍生物的信号衰减很快，一天变化很大。从以往我们 做的实验来看此方法的变异系数CV%一般为5％左右，个 别的氨基酸如组氨酸可达9%左右，尤其对带有盐分的饲 料氨基酸类样品特别不适合，因样品中带有的盐分直接 影响衍生（紫外法基线不好）。
氨基酸分析仪基本分析原理
各种蛋白质都是由20种氨基酸首尾相连，并以一定的 顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨 基酸进行分析。所有的氨基酸在低PH值的条件下都带有正 电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不 同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性 氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定 的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依次将氨基 酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸 最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液 在加热的条件下反应（135度），生成可在分光光度计中 570nm和440nm检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质 440nm检测)，外标法定量。
缺点：水解时间长、而且不易水解完全。
提示：作为氨基酸全分析不可采用此法。
目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺 均为酸水解法。
4、微波消解法：微波消解技术，近年来在化学领域尤其是在氨基酸样品前 处理方面显示出了良好的应用前景。
常规的水解方法：需要在一定条件下水解22—24小时，该法存在水解时间 长、耗时耗电、不利于快速检测大量样品前处理工作。
（三）D-CL法（丹酰氯） （反应机理略）
反应比较简单以5个mol/L比例，在室温、避光条件下几时 分钟即可完成反应。
缺点不足之处是：衍生物对紫外比较敏感，反应必需要在 避光下进行，赖氨酸、组氨酸和胱氨酸均生成二级衍生物 影响准确测量。
（四）2、4-二硝基氟苯法（反应机理略）
此方法是比较常见的液相测定方法，最大的缺点是衍生剂 峰比较大，对柱子危害比较厉害。组氨酸分离不好、组氨 酸的二级衍生物与丝氨酸重叠，另一个峰柱效降低时完全 溶入到前面苯丙峰中，直接影响定量，日间变化比较大。
茚三酮反应
（四）氨基酸的分离分析
特殊沉淀法 离子交换法 萃取法 毛细电渗析
离子交换法分离分析氨基酸的原理
根据氨基酸是两性电解质这一特性， 以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值 的差异，利用离子交换树脂对各种氨基 酸吸附能力的不同进行分离纯化。
二、氨基酸分析仪
氨基酸分析仪的定义：
日立L-8900全自动氨基酸分析仪
日立氨基酸分析仪的历史
KLA-5
四十多年的历史，拥有2000多用户
835
L-8800
L-8900
Sold KLA in 1962
L-8500
L-8900 AAA的内部结构
L-8900 AAA的组成
组件名称 缓冲液 色谱柱 泵 自动进样器 柱温箱 反应单元 检测单元 控制系统
氨基酸分析仪与HPLC常规比较
三、样品的制备
（一）蛋白质的水解 （二）游离氨基酸样品的制备
（一）蛋白质的水解
用于全氨基酸测定的样品，凡是以蛋白质形式存在 的都要进行水解处理，水解方法有三种： 1.酸水解法：标准水解法，是普遍采用的水解方法，在水 解过程中采用6N的盐酸作为水解剂，此方法的特点是水 解彻底，水解后的氨基酸全部以L-型形式存在，但色氨 酸遭破坏。（6NHCL、110℃真空水解24小时）
1 灵敏、快速、提供数据准确可靠：分辨 率高、操作简单，分析周期短（水解30分 钟、体液110分钟）。 2 保留时间、峰面积、重现性好，检出限 可达3pmol。 3 不存在液相方法生成二级衍生物的问题。 4 峰形显高斯分布，体系稳定快（半小时 即可）。