（三）D-CL法（丹酰氯） （反应机理略） 反应比较简单以5个mol/L比例，在室温、避光条件下几时 分钟即可完成反应。 缺点不足之处是：衍生物对紫外比较敏感，反应必需要在 避光下进行，赖氨酸、组氨酸和胱氨酸均生成二级衍生物 影响准确测量。 （四）2、4-二硝基氟苯法（反应机理略） 此方法是比较常见的液相测定方法，最大的缺点是衍生剂 峰比较大，对柱子危害比较厉害。组氨酸分离不好、组氨 酸的二级衍生物与丝氨酸重叠，另一个峰柱效降低时完全 溶入到前面苯丙峰中，直接影响定量，日间变化比较大。
（三）氨基酸的化学性质
氨基酸分子中都具有氨基和羧基， 因此它们都能产生氨基与羧基的一般反 应，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱 的中和作用等。有些氨基酸由于存在其 它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的 巯基（－SH)。
茚三酮反应
（四）氨基酸的分离分析
特殊沉淀法 离子交换法 萃取法 毛细电渗析
离子交换法分离分析氨基酸的原理
离子交换树脂
专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性 阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树 脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂 是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树 脂的粒度一般在５～１０μｍ之间，交联度多为８ ％～１２％。 交联度大，树脂的网状结构紧密、孔隙度小，对外 界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能 进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择 性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分 离；交联度小，树脂结构疏松、孔隙度大，适合用 于蛋白质、肽类的分离。
L-8900 AAA的流程图
L-8900 AAA的性能指标
以蛋白水解液标准分析方法为例： 净分析时间：30分钟 检出限：3 pmol(信噪比=2，天门冬氨酸） 保留时间重现性：CV 0.3% （精氨酸） 峰面积重现性：CV 1.0% (甘氨酸、组氨酸）
氨基酸分析仪最大的特点：
1 灵敏、快速、提供数据准确可靠：分辨 率高、操作简单，分析周期短（水解30分 钟、体液110分钟）。 2 保留时间、峰面积、重现性好，检出限 可达3pmol。 3 不存在液相方法生成二级衍生物的问题。 4 峰形显高斯分布，体系稳定快（半小时 即可）。
3、酶水解法：酶是有机催化剂，它不需要高温高压，而是
在常温常压下即可催化有机物质的合成与分解。 优点：水解条件温和，无需特殊设备，氨基酸不受破 坏；产物中除氨基酸外尚有较多肽类，目前来讲还没有 一种酶能全部完全水解蛋白质；与酸法比较酶法要考虑 酶试剂的种类、量、温度、PH值等因素，此方法主要用 于生产水解蛋白及蛋白肽。 缺点：水解时间长、而且不易水解完全。 提示：作为氨基酸全分析不可采用此法。 目前日本、欧洲和我国植物蛋白水解生产上采用的工艺 均为酸水解法。
氨基酸分析仪基本分析原理
各种蛋白质都是由20种氨基酸首尾相连，并以一定的 顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨 基酸进行分析。所有的氨基酸在低PH值的条件下都带有正 电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不 同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性 氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定 的洗脱程序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依次将氨基 酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸 最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液 在加热的条件下反应（135度），生成可在分光光度计中 570nm和440nm检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质 440nm检测)，外标法定量。
Ｒ ｜ Ｈ-Ｃ－ＣＯＯＨ ｜ ＮＨ２
组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即 а-碳原子。 а-碳原子有四个不同取代基：羧基、 氨基、氢原子和R基团，不同 氨基酸的R基团不同。 每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L-构型。 广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样等）。
日立L-8900全自动氨基酸分析仪
日立氨基酸分析仪的历史
KLA-5
四十多年的历史，拥有2000多用户
835 L-8800 L-8900
Sold KLA in 1962 L-8500
L-8900 AAA的内部结构
L-8900 AAA的组成
组件名称 缓冲液 色谱柱 泵 自动进样器 柱温箱 反应单元 检测单元 控制系统 参数 6种（试剂与清洗液） 4.6mm id x 60mm， 阳离子树脂填充（标配) 0.001-0.999ml/min, 0-20MPa, 2 1500µl; 200vial (200 cooler) ; 0.1-100µl 20-85℃（1℃）, 电子加热/制冷的温控装置。 50℃ --140℃,电子加热的温控系统 可见分光光度计（570，440nm） EZChrom Elite 分析软件 CPU: 32bits OS, Windows xp
L-8900 AAA的分析原理
1、样品中的氨基酸在低PH的条件下都 带有正电荷,在阳离子交换树脂上均被 吸附,但吸附的程度不同,碱性氨基酸结 合力最强其次为中性氨基酸、酸性氨基 酸结合力最弱。 2、按照氨基酸分析仪设定的洗脱程 序，用不同离子强度、PH值的缓冲液依 次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来， 3、分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高 温反应器中进行衍生反应，生成可以被 分光光度计检测的有色物质，然后在检 测器中被检测出来。
氨基酸分析仪法与HPLC法比较
近年来常见常用的检测氨基酸的液相方法不少，主 要介绍以下几种常用的方法与氨基酸分析仪法进行比较： （一）OPA法（邻苯二甲醛）（反应机理略） 最大的不足之处是：做全分析时需配以其他技术一起使 用，方可与带有仲氨基团的氨基酸进行反应。赖氨酸及 胱氨酸衍生物荧光较弱，灵敏度低。因为OPA是快速反应 剂，有些氨基酸反应极其不稳定，特别是甘氨酸、赖氨 酸衍生物的信号衰减很快，一天变化很大。从以往我们 做的实验来看此方法的变异系数CV%一般为5％左右，个 别的氨基酸如组氨酸可达9%左右，尤其对带有盐分的饲 料氨基酸类样品特别不适合，因样品中带有的盐分直接 影响衍生（紫外法基线不好）。
氨基酸分析仪基本原理及应用
上海交通大学分析测试中心 侯敬丽
内容
一、氨基酸 二、氨基酸分析仪 三、样品的制备 四、应用
一、氨基酸（amino acids）
（一）氨基酸的定义
氨基酸：是生物功能大分子蛋白质的基本组成 单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。 氨基酸含有一个碱性氨基和一个酸性羧基，氨 基一般连在α-碳上。
根据氨基酸是两性电解质这一特性， 以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值 的差异，利用离子交换树脂对各种氨基 酸吸附能力的不同进行分离纯化。
二、氨基酸分析仪
氨基酸分析仪的定义：
氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年 的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解 氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨 基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各 行各业。它与其它分析仪器区别在于只能检测 氨基酸不能作为它用，具有专一性。从仪器的 配置上来讲应配备专用的阳离子树脂氨基酸分 离柱、微量的输液系统、专用的检测器、反应 系统及符合国际、国内、涉外标准的检测方法 （离子交换柱后茚三酮衍生方法）。
丙氨酸 天冬酰胺 半胱氨酸 谷氨酰胺 组氨酸 赖氨酸 苯丙氨酸 丝氨酸 色氨酸 缬氨酸 Ala(A) Asn(N) Cys(C) Gln(O) His(H) Lys(K) Phe(F) Ser(S) Trp(W) Val(V) 6.02 5.41 5.02 5.65 7.58 9.74 5.48 5.68 5.88 5.97 精氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 甘氨酸 亮氨酸 蛋氨酸 脯氨酸 苏氨酸 酪氨酸 异亮氨酸 Arg(R) Asp(D) Glu(E) Gly(G) Leu(L) Met(M) Pro(P) Thr(T) Tyr(Y) Ile(I) 10.76 2.98 3.22 5.97 5.98 5.75 6.30 6.53 5.65 6.02
（二）氨基酸的分类
按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类： 中性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 苏氨酸、丝氨酸（以上七种又称脂肪族氨基酸）、苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸（这三种又称芳香族氨基酸）、蛋氨酸、胱 氨酸、半胱氨酸（含硫氨基酸）、脯氨酸、羟脯氨酸（属亚 氨基酸类） 酸性氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸 碱性氨基酸：赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸 酸性氨基酸 中性氨基酸 碱性氨基酸 pI pI pI 2.8-3.2 5.0-6.3 7.6-10.8
（二）PITC法（异硫氰酸苯脂） （反应机理略） 此方法的重现性明显低于茚三酮法，最大 的缺点是：一个组分衍生后可生成2个以上的 衍生物，而且和其它组分峰重叠，灵敏度比较 低。由于有残留的衍生剂，柱效与柱寿命降低 很快（做200左右样品），变异系数在4%左 右，也偏大，个别氨基酸如组氨酸可达8%，某 些氨基酸在24小时内即降解。
氨基酸分析仪洗脱过程
1.氨基酸在PH2.2的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均 被吸附,但结合强度各不相同。
2.随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地吸附、解吸附。 由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小）,吸附强度 有差异。 3.不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同：碱性氨基酸> 芳香 族氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸及羟基氨基酸。 4.提高流动相PH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离 子交换柱上洗脱下来。洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨 基酸、碱性氨基酸。 5.氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺 序一定;标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定;由此 可计算出样品中各种氨基酸的含量。
2、碱水解法：用2.5N氢氧化钠（氢氧化锂）作为水解
剂，色氨酸不被破坏，但有消旋作用，丝氨酸、苏 氨酸、精氨酸、胱氨酸遭到不同程度的破坏。(水解 时20小时） 优点：水解液清亮。 缺点：使氨基酸发生外消旋作用，水解产物氨基酸 有L-型和D-型，水解过程中会放出氨气和硫化氢。 提示：只是为了测定蛋白质中色氨酸：