实验一 聚合酶链反应（PCR）
4、反应条件（要摸索最佳条件，尤其 是退火温度；如何降低非特异性） 95℃变性
5 Min
94℃
1 ‘
1 ‘
58℃
30’’
35个循环
72℃ 72℃延伸10 min 4℃
实验一 聚合酶链反应（PCR）
5、电泳检测
取8-10μl扩增产物于上样膜上，加1.5μl上样缓冲 液混匀后点样。 0.8%琼脂糖凝胶的配制： 称取0.8g琼脂糖粉，加入100ml 1×TAE中，加热煮沸使琼 脂糖完全熔化，稍稍冷却后，加入5μl 10mg/ml的溴化 乙锭（EB），混匀后倒入电泳槽中，制备凝胶。
实验四 连接产物转化
5、取100μl转化的感受态细胞转移到含相应抗生素（Kan ）的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均 匀地涂布到琼脂平板表面。 6、将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培 养，12-16h可出现菌落。
注意事项：热激时间、复苏转速、新制备的平皿注意“发汗” 如果是转化质粒，可以简化复苏这一步
五、转化大肠杆菌DH5α
本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE
实验基本原理的思考题：
1、PCR引物设计原则 2、PCR的种类及用途 3、提高PCR反应特异性的策略 4、限制性内切酶的同尾酶、Star活性
病原分子生物学实验技术
保护性碱基
通常保护性碱基添加2-3 个，但是不同公司的限制 性内切酶的保护碱基个数 有所不同 可通过添加不同保护性碱 基，使上下游引物GC含量 尽可能一致 根据实验要求添加酶切位 点和保护性碱基，如果 PCR产物直接连T载体则可 不用添加保护性碱基 TaKaRa公司
实验一 聚合酶链反应（PCR）
王荡
wangdang511@
华中农业大学动物病毒室 2013级
本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE
实验三 感受态细胞的制备
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏
用接种环以无菌操作取细菌悬液，在平板培养基的一边，做第一次平行划线。 转动培养皿，用烧过冷却的接种环，通过第一次划线部分，做第二次平行划线。 用同法通过第二次平行划线，做第三次平行划线。
PRRSV ORF7的PCR扩增 1、引物 P1：5’-CATGGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’ (BamHI) P2：5’-CACAAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’ (HindIII) 2、模板（质粒） 用前于沸水浴中变性10min，迅速置冰浴上不少于3min
读码框校正（Sal I+Xho I）
30a（+）
5‘-CGTCGACATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’
Arg-Arg-His-(移码的PRRSV ORF7)
读码框校正（Sal I+Xho I）
30a（+）
5‘-CGTCGACAAATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’
注意事项：菌体不能超过对数生长期；冰上操作；无菌操作
感受态细胞效率检测
Amp+ Kan+
直接涂感受态
直接涂感受态
转Amp+抗性的质粒
转Kan+抗性的质粒
实验四 连接产物转化
1、取100μl感受态细胞悬液转移到无菌的1.5mlEP管中， 加入10μl连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放 置30min（实验中设一不加质粒DNA的对照）。 2、将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒 3、快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。 4、每管加400μl LB 培养基。用水浴将培养基加温至37℃ ，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌 复苏。（为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/ 分）。
实验五/六 质粒提取
目前已经有商品化试剂盒，但通过经典方法提取，有助 于掌握基本原理。 在购买质粒提取试剂盒时，应注意所提取质粒的用途， 如果是用于将来的转染或动物实验，应采用去内毒素的 试剂盒。
沉淀法回收PCR产物
1、将3管PCR产物混合后加入适量的水至500ul，加等体积的苯酚∶氯 仿∶异戊醇（25∶24∶1）涡旋混匀，12000r/min离心5min 2、取上层液相于另一离心管中，加2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体 积的3M NaAc，混匀后于-20℃沉淀30min 3、12000r/min离心5min，小心吸去上清液，将离心管倒置于吸水纸 上，以使所有液体流出 4、用70%乙醇洗一次，倒掉洗液并倒置吸水纸上让痕量液体流尽。然 后用真空干燥器抽干或自然干燥直到无乙醇气味 5、用35μl ddH2O溶解
PCR电泳检测结果
M1 1 2 3 4 5 6 7 M2
15000bp 2000bp 500bp 250bp 100bp 2000bp 1000bp 250bp
对照
ORF7 PCR产物
胶回收法回收PCR产物
1、将PCR扩增产物，在0.8%琼脂糖回收胶中上样电泳。 2、在长波紫外灯下，用刀片切下目的片段，装入1.5ml离心管中 ，按回收试剂盒说明书进行回收，最后用20μl ddH2O洗脱， 获得目的片段
酶切体系： DNA 10X Buffer K BamHI HindIII ddH2O 37℃ 2-3h 4.0μl(根据浓度确定用量） 3.5μl 1.0μl 1.0μl 25.5μl
酶切注意事项
了解各种限制性内切酶的特性与使用 Star活性（注意酶的用量、时间、温度） 酶切时间 酶切温度 双酶切(侧翼序列、Buffer)
实验要求
1、注重实验设计 2、严格操作程序 3、注意生物安全 4、了解实验原理
实验预期目标
1、掌握DNA操作和原核表达的基本实 验技能 2、提高独立进行实验设计的能力 3、了解DNA操作和原核表达实验技术 的基本原理(自己查资料）
参考书：分子克隆实验指南
本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE
实验一 聚合酶链反应（PCR）
以原核表达PRRSV ORF7基因为例 引物设计 模板制备 PCR反应体系以及扩增条件 PCR产物电泳检测
载体选择
蛋白特性分析（信号肽、跨膜区）
/tools/
SignalP软件
引物设计
上游引物：ATGCCAAATAACAACGGCAAGC 下游引物：TCATGCTGAGGGTGATGCTGTG
实验一 聚合酶链反应（PCR）
引物的设计 已知基因序列 部分序列已知 5’/3’ RACE 高度变异序列 简并引物
实验一 聚合酶链反应（PCR）
模板的处理 细菌 细胞培养物 质粒 病毒基因组DNA 病料 鼻拭子
实验一 聚合酶链反应（PCR）
PCR PCR （DNA) RT-PCR (RNA) 套式PCR 荧光定量PCR
酶切位点添加
载体自连？
PRRSV ORF7酶切位点
插入方向？ 同尾酶？
读码框校正（BamH I+Hind III）
30a（+）
5‘-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGAAAGCTT -3’
Gly-Ser-Met-(PRRSV ORF7)-(TGA)
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏 2、从大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落，转到一个含 50mL LB培养基的盐水瓶中，于37℃ 300转/分剧烈振荡 培养3-4h。为得到有效转化，活细菌数不应超过108细胞 /ml，一般以稍见浑浊为宜。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌，用冰预冷的50ml 聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到 0℃。 4、于4℃ 4000转/分离心10min，回收细菌。
病原分子生物学实验技术
王荡
wangdang511@
华中农业大学动物病毒室 2013级
实验内容
实验一、聚合酶链反应（PCR） 实验二、外源DNA片段的克隆 实验三、感受态细胞的制备 实验四、细菌转化 实验五、质粒的小量制备与鉴定 实验六、质粒的大量制备 实验七、原核表达与表达产物的提取 实验八、SDS-PAGE电泳 实验九、病毒基因组DNA的提取
实验三 感受态细胞的制备
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏 2、从大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落，转到一个含 50mL LB培养基的盐水瓶中，于37℃ 300转/分剧烈振荡 培养3-4h。为得到有效转化，活细菌数不应超过108细胞 /ml，一般以稍见浑浊为宜。
实验三 感受态细胞的制备ຫໍສະໝຸດ 实验二 外源DNA片段的克隆
三、外源片段或载体酶切产物的回收 制备回收胶，将所有酶切产物上样电泳回收，用12μl ddH2O洗脱。（一般来说，回收后应电泳观察浓度） 四、外源片段与载体的连接
连接体系（不是一成不变的，要根据经验） DNA片段 10μl pET-30a(+) 7μl 10×T4 Ligase buffer 2.0μl T4 Ligase 1.0μl 22℃ 10min或者过夜(Thermo，不同公司的连接酶反应条件不一样）
Arg-Arg-Gln-Met-(PRRSV ORF7)-（TGA）
引物设计注意事项
载体N端有标签，上游引物要对读码框；下游引物要加终止 密码子 载体C端有标签，上游引物要加起始密码子，且考虑是否加 Kozak序列（真核表达系统）；下游引物要对读码框，并且 要去掉基因本身的终止密码子 利用真核表达系统表达分泌蛋白，其信号肽一般添加在载体 的N端；如需要用标签纯化该蛋白，这需将标签添加到该蛋 白的C端，同时去掉基因本身的终止密码子