实验一：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察【基本原理】细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。

凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。

凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。

可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。

本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。

当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。

由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。

【实验报告】1．简图表示凝集素使血细胞凝集原理2．怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度？物质进入细胞的快慢有什么规律？实验二：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合【基本原理】两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。

在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。

人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。

细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。

不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。

因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。

这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。

细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。

人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。

细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）和电脉冲。

目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。

聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。

普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。

【实验结果】在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体细胞。

要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。

【实验报告】l．在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。

2．什么是同核体、异核体? 细胞融合主要有哪几种方法？简述细胞融合的应用。

实验三：线粒体和液泡系的超活染色与观察【基本原理】线粒体是细胞内一种重要细胞器，细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。

活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。

詹纳斯绿B（Janus green B）是线垃体的专一性活细胞染色剂，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。

线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，从而使线粒体显色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。

细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。

中性红对液泡系的染色具有专一性，将活细胞中的液泡系染成红色。

实验四：植物细胞微丝束的光学显微镜观察【基本原理】细胞骨架在通常情况下不稳定：如低温、高压、饿酸处理等。

当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。

微丝、微管和中间纤维都是直径很小的结构，最大的单根微管才25nm左右，只能在电镜下才能观察到。

目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微镜技术。

本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。

由于细胞经TritonX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。

细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。

它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。

光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。

【实验报告】1．光镜下观察到的细胞骨架有何形态特征？2．请设计一个实验鉴定你所观察到的细胞骨架是哪一类型。

3．为什么本实验中考马斯亮兰R250染的是微丝？4．实验中的各种试剂分别有何作用？附：各种主要试剂的作用1．Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂；适当浓度的Triton X-100，可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存2．M－缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压3．EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可是微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度。

4．戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；5．考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）实验五：叶绿体的分离与荧光观察【基本原理】细胞经过破碎后制成匀浆，在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

利用细胞各组分质量大小、形状和密度的不同，选择不同的离心力和离心时间，即可分离得到所需要的细胞器或大分子组分。

几乎所有的植物组织中都有质体的存在。

叶绿体是研究最透彻的质体。

分离完整叶绿体有三个主要困难：1）有细胞壁包裹。

破碎细胞的力量要能足以打破细胞壁的同时保持叶绿体的完整性。

2）叶绿体中由于淀粉积累成致密颗粒会在离心过程中使叶绿体破碎。

淀粉的积累可以通过自然植物在短光照时间和/或低光照强度的条件下生长而得以消除。

若有必要可以在匀浆前将植物放在黑暗中24-48hr以除去淀粉。

3）匀浆过程中，液泡中储藏的有毒物质会释放出来。

在有酚类化合物积累的物种中，可以通过在研磨缓冲液中加入可溶解的聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白（BSA）和巯基化合物来降低其有毒影响。

菠菜是分离完整叶绿体的极好材料，其细胞中所含的质体较大，而且它们都能在不积累淀粉和酚类物质的条件下生长。

菠菜的叶绿体/湿重比率较高。

叶绿体具有荧光现象，可利用荧光显微镜观察。

菠菜叶富含叶绿体，可采用徒手切片观察其形态和分布叶绿体的分离在等渗溶液中进行（0.38mol/L甘露醇,4mmol/L—50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

用8层纱布除去组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后在3000g条件下离心6min , 即可获得沉淀的叶绿体。

离心技术可用于细胞器的分离。

分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞成分的分离。

常用离心技术一般包括差速离心法和密度梯度离心法。

1）差速离心法采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度和离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。

常用于从组织匀浆中分离各种细胞器，见表2-1。

表差速离心形成的沉淀（植物）2）密度梯度离心当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。

密度梯度离心主要有两种类型，速率区带离心和等密度梯度离心。

等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。

介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。

此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大的核酸、亚细胞器和质粒等。

实验六：DNA的显示——Feulgen反应【基本原理】Feulgen反应（Feulgen reaction）是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck 于1924年发明，简称为Feulgen法。

因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA 的分布情况。

自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。

其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。

Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。

也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

其反应机制如下图所示。

2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3【实验报告】1．绘图表示Feulgen反应的染色结果。

2．总结Feulgen反应染色结果的影响因素。

3.在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？附：Feulgen方法应注意的几个问题：1．对照切片的制做：进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。

对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。

但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h （0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。

2．固定剂的选择：以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。