形态标记 (morphological markers)
细胞学标记 (cytological markers) 生化标记 (biochemical markers) 分子标记 (molecular markers)
2.1.1 形态标记

指能明确显示遗传多态性的外观性状， 如水稻株高，果蝇眼色等； 典型的形态标记用肉眼即可识别 和观察，广义的形态标记还包括 那些借助简单测试即可识别的性 状，如生理特性、抗病虫性等； 形态标记简单直观、经济方便， 容易观察记载。
重叠群法

利用克隆步移法测序，国际上通行的标准要求BAC测序达 到十倍覆盖率，使所测的序列达到99.99％以上的准确度。的工作。 此外，费用相对于鸟枪法要稍高一些，完成整个基因组测 序周期也要长些。但是，通过这种方法得到的基因组数据 是最为准确和精细的数据，也是基因组测序的最终目标。 大基因组“完成图”目前大多都是通过这种方法获得的。 基因组“完成图”，即完全覆盖所测物种的基因组、准确 率超过99.99％的全DNA序列图。“完成图”的覆盖率接近 100％，准确率更高，达到99.99％。

对于真核生物基因组，首先需建立一个基因组的图谱 (genome map)，通过标明基因和其他显著特征的位置， 为测序提供指导。
基因组图谱的绘制——全面测序的工作框架 根据等位基因在减数分裂中的重组 遗传 频率 (遗传距离) 确定基因在基因组 图谱 中的顺序和相对距离。cM；
基因组 图谱
物理 以物理距离描绘DNA上可识别标 图谱 记的位置和相对距离。bp, kb, Mb。
DNA标记的种类

限制性片段长度多态性 (RFLP, restriction fragment length polymorphism)； 简单序列长度多态性 (SSLP, simple sequence length polymorphism)；
–小卫星序列：（Minisatellite

DNA）
SDS-PAGE separates proteins by MW
Animation
2.1.4 DNA标记

基于DNA水平遗传多态性构建的分子标记。
DNA分子标记的优点

遗传多态性丰富； 共显性遗传，信息完整；
在基因组中大量存在且分布均匀；
稳定性、重现性好； 检测手段简单快捷，易于自动化，成本较低。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
以大片断定位的克隆为基础的定向测序战略主要采用
克隆步移法或称重叠群法：

先构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文 库（BAC、PAC等）获得精细的物理图，选择合适的 BAC或PAC克隆测序，利用计算机拼装。BAC内的空洞 基本上都可以利用设计引物等手段填补，形成一条完整 的BAC序列。然后由相互关联、部分重叠的BAC克隆连 成一个大的重叠群（Contig）。理想状况下，整条染色 体就是由一个完整的重叠群构成。




2.1.3 生化标记

是指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。 主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记； 与形态、细胞学标记相比，数量丰富，受环境影响小，能 更好地反映遗传多态性。应用于物种起源和进化研究、种 质鉴定分类、抗病性筛选等。

不足之处

同工酶标记都需要特殊的显色方法和技术； 某些酶的活性具有发育和组织特异性； 标记的数量还是相对有限。


SSLP （简单序列长度多态性）

SSLP是一系列不同长度的重复序列，不同的等位基因含有 不同的重复单位。有两种类型：

小卫星序列 (minisatellite)：又称可变数目串联重复 (variable number of tandem repeat, VNTR)，重复单位可以 是几十个核苷酸；
微卫星序列 (microsatellite)：或称简单序列重复 (simple sequence repeat, SSR) ，简单串联重复 (simple tandem repeat, STR)。重复单位较短，常为2, 3或4个核苷酸单位， 重复次数一般10-50次。

小卫星DNA
简单序列长度多态性：微卫星序列


RFLP
由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变 引起的；

最早由Bostein 于1980年提出， 是第一种用于 作图研究的分 子标记，第一 代DNA分子标 记。

同源染色体同一区段DNA 序列的差异， 限制酶识别的碱基顺序有专一性
RFLP标记的特征

同一亲本及其子代相同位点上的多态性不变； 共显性，同一凝胶电泳可显示不同多态性片段； 实验操作较繁琐，成本较高；探针必须是单拷贝或寡拷贝 的，制备较麻烦；检测中如要利用放射性同位素，易造成 环境污染；检测周期长； 检测所需样本DNA量大(5~15ug)； 可以用非放射性物质，但杂交信号相对较弱，灵敏度较同 位素标记低，且相对价格较高。
每个SSR座位 两侧一般是相 对保守的单拷 贝序列
鸟枪法是小的原核生物基因组测序的标准方法
用鸟枪法获得流感嗜血杆菌的基因组序列
鸟枪法不适用于较大的、复杂的真核生物基因组

随着片段数的增加，所需的数据分析越来越复杂。n个片 段可能的重叠数为2n2-2n；
分析基因组的重复区域时会发生错误。 串连重复DNA的问题 基因组范围内重复的问题

重叠群法


遗传作图中的第二代DNA标记
简单序列长度多态性 SSLPs

发现：
– –
小卫星序列minisatellite （1985年） 微卫星序列microsatellite （1989年）

microsatellite marker又称简单串连重复（short tandem repeat，STR），最重要 的优点是高度多态性，提供的信息量相对很大；另外可用PCR技术使操作实 现自动化，遗传图与物理图研究中非常有用的工具 20世纪80年代后期,人们开始应用微卫星序列(microsatellite,MS)绘制图谱。1994 年底，美、法完成了以RFLP及微卫星ＤＮＡ为标志的遗传图谱.图谱包含了 5826位点，覆盖4000cM，分辨率高达0.7cM．1996年法国报道了完全以微卫 星DNA标志构建的遗传连锁图，包含2335位点，分辩率为1.6cM
遗传作图中DNA标记的发展


遗传标记的发展：
第一代标记 – 经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记） – 70年代中后期，限制酶片段长度多态性（RFLP） 第二代标记 – 85年，“小卫星序列"（minisatellite） – 89年，“微卫星序列"（microsatellite） 第三代标记 – 单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism ，SNP）
基因组作图的基本构想是，在长链DNA分子的不同位臵寻 找特征性的分子标记，根据分子标记将包括这些序列的克 隆进行连锁定位，绘制基因组图。一旦构建好基因组图， 即可着手进入全基因组测序。

一、基因组测序的策略

如果将每个碱基比作一个英文字母，以每10cm书写60个 字母计算，人类基因组共30亿个碱基，其长度可达5000 千米，相当于从北美洲的蒙特利尔横跨大西洋到达伦敦， 洛杉矶到达巴拿马； 当前测序方法的局限：<750bp 需将DNA分子打断为小 片段，测出每一段序列，再通过重叠部分拼接成长的序 列。 鸟枪法(shotgun method)。

基因组作图的方法

遗传作图 (genetic mapping)：采用遗传学分析方法将基 因或其他DNA分子标记标定在染色体上。构建的连锁图 称为遗传连锁图谱(genetic linkage map)或遗传图谱 (genetic map)。方法包括杂交实验、家系分析。图距单位 为cM； 物理作图 (physical mapping)：采用分子生物学技术直接 将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。 构建的位置图称为物理图谱 (physical map)。图距单位： bp、kb、Mb，cR(厘镭，辐射杂种作图)。
但是用它来测序，最终排序结果的拼接组装比较困难，尤其在部分 重复序列较高的地方难度较大。此外有许多序列片段难以定位在确 切的染色体上，成为游离片断；同时又会有许多地方由于没有足够 的覆盖率而形成空缺。这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的 空洞（gap），也影响其准确度
鸟 枪 法 组 装 序 列
将DNA分子打断为小片段，测定每一段序列，通过查找每个 片段序列的重叠部分(需几十个碱基)，再组装得到主体序列。

二、 遗传作图
2.1 遗传作图的标记

遗传标记：是指可以稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传 多态性形式； 经典遗传学中，遗传多态性指等位基因的变异；现代遗传 学中，遗传多态性指基因组中任何座位上的相对差异或 DNA序列的差异； 遗传标记可用于连锁分析、基因定位、遗传作图、基因转 移、辅助选择育种等；
基因组作图
郭风劲
细胞生物学及遗传学教研室 发育生物学与模式动物平台
guo.fengjin@ /renshishizi/index.html
染色体结构与基因
基因组计划的基本目标

获得全基因组顺序，在此基础上再对所获得的序列进行解 读。获得基因组顺序的主要方法是进行DNA测序，然后再 将读取的顺序组装。目前的DNA测序每次反应仅能读取不 到1000bp的长度，因此基因组测序的第一步是构建基因组 图，然后将基因组区段分解逐个测序，最后进行组装。


遗传作图中的第一代DNA标记

现代遗传图谱的概念由Botstein D等(1980)首先提 出，在此基础上，限制性片段长度多态性 （RFLP）作为遗传图谱的第一代崭新标记得以 问世 。