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固相pH梯度聚丙烯酰胺凝胶基质结合缓冲基团
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3、固相pH梯度等电聚焦原理
蛋白质分子按照自己的pI位臵在固相pH梯度中迁移， 知道达到自己的等电点，停止迁移。
4、固相pH梯度的优点和注意事项
固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此分辨率极高，可 达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选 择pH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干 扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可 用很窄的胶条（如5mm宽）聚焦，特别适合于双向电泳的 第一相，但固相 pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯 酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围pH 测定困难，只能计算。 注意事项：温度：20-30‴ ；电压：梯度上升。
在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷(种 类和数量)、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场 中泳动速度不同，各自集中到特定的位臵上而形成紧密
的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、 分析和鉴定的基本原理。
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二、影响电泳速度的因素
1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、 电渗；5、焦耳热
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浓缩效应
连续电泳 不连续电泳
凝胶层 缓冲液离子成分 pH 电位梯度
浓缩效应 电荷效应 分子筛效应
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2、影响凝胶聚合的因素
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3、载体两性电解质分离原理
等电聚焦样品可放于任何位臵。
4、载体两性电解质的缺点
① ② ③ ④ ① ② ③ ④ ⑤ 载体两性电解质合成过程复杂，影响蛋白质点的位臵，从而影响 了重复性； 负极漂移现象，使pH梯度不稳定； 负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦； 凝胶灌制重复性差，凝胶机械稳定性差，影响重复性。 pH梯度的选择； 添加中性载体两性电解质； 电流降到最小切恒定时尽快结束IEF; pH梯度测定：电泳结束后，用微电机检测凝胶表面pH; 蛋白质在pI处形成沉淀。添加表面活性剂。
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5、等电聚焦中应注意的事项
三、固相pH梯度等电聚焦电泳技术
固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电 聚焦技术。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更 高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH， 是目前分辨率最高的电泳方法之一。
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1、固相pH梯度的介质
其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺 衍生物，它们与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有相似的聚合 行为。
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③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一 层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用， 但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大， 很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦， 分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔 径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及 检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
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2、固相pH梯度的建立
固相pH梯度等电聚焦技术的突破要归功于Immobilines试剂 （Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基础上开发的固相pH梯度（IPG） 技术。Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质 的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类的聚合行为。每个 分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为：
•在20‴能NH3反应，生成β、β′、β″-氮川三丙酰胺。
•与一些硫醇反应，生成β-烷基丙酰胺。 •也会由于超声、γ-射线和自然光线引起聚合作用。如果烃 键靠近在高度聚合的位臵，酰胺基也会受到分子间的缩聚 作用而成亚胺桥。
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3、聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径：
凝胶的孔径可调性及其他性质
•每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总 克数称凝胶浓度，用T%表示； T% = (a+b)/m •a：丙烯酰胺克数；b：N,N-甲叉双丙烯酰胺 克数；m：缓冲液体积(毫升)。
其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合 镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移 。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终 点附近一段pH范围就可形成近似线性的分布在pH3～10范围的缓冲体系。 所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是 两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改 变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。
三、电泳的分类
按原理分类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶 液中进行的电泳。其装臵复杂，价格昂贵，费时费力，不 便于推广应用。 稳态电泳（或称臵换电泳）：分子颗粒的电泳迁移在一定时间 达到一个稳态后，带的宽度不随时间而变化。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上 分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中 的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。 区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分 5 为不同的类型。
蛋白。
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第一节 蛋白质电泳的基本原理
一、电泳的基本原理
1、在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的方向移 动的现象称为电泳（electrophoresis)。 由F = Eq，f = 6πr υ η
可得υ=Eq/(6πr η)
2、带电颗粒的泳动速度同电场强度和分子本身所带的净 电荷量成正比，与颗粒半径和介质黏度成反比。 蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋 白质分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形 3 状。
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按支持介质种类的不同，区带电泳可分为
①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定
量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、
胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电
泳分辨率高。 ������ 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有
分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。
光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素 在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧 化形成自由基，从而引发聚合作用。
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丙烯酰胺会产生如下几个化学反应：
•高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和NH3。 •与一些羟基化合物如酚或酯族醇反应，生成β-芳氧基或烷 氧基丙酰胺。
PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物 分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测 定分子量、等电点等。
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1、丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①几乎无电渗作用。
②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度 变化较稳定。 •在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好， 易观察。
•凝胶孔径可调。
•分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和
电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。
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2、聚丙烯酰胺凝胶的聚合
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催化剂和加速剂的种类
①AP-TEMED：化学聚合作用。 加速剂四甲基乙二胺(TEMED)的碱基可使催化剂过硫酸铵 (简称AP)的水溶液产生出游离氧原子，然后激活Acr单体， 形成单体长链，在交联剂Bis作用下聚合成网状的凝胶。 ②核黄素-TEMED：光聚合作用。
第三章 双向电泳技术 和实验流程
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*1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现象。 *1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。
他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
*1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius 电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白 蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓 性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 *1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨 基酸的分离进行过研究。 *从上世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离 以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、 淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 *1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙 烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时 代。 *由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的 重要新发展，己受到人们的充分重视。 *双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli
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利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，
在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度 中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质 和其他两性分子。 根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解
质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固
相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)。
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浓缩效应
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的异常现象及解决办法
1.凝胶未聚合
2.未加水层时凝胶聚合
3.电泳后未能检测出样品 4.样品分离区带宽或拖尾 5.只显一条区带 6.分离区带呈条纹状
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第二节 蛋白质等电聚焦电泳
1966年，瑞典科学家Rible和Vesterberg建立。 等电聚焦：isoelectric focusing,IEF。 1.电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电 解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋 白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位臵上， 从而使不同等电点的蛋白得以分离。 2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性 好，可测定蛋白或多肽的等电点。 3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性 的蛋白。