实验二细菌的芽孢染色, 鞭毛染色, 荚膜染色生物科学贺冰冰 040012010025 周二 9、0 节
一、实验目的
1 学习细菌的芽孢染色法
2 学习细菌的鞭毛染色法
3 学习细菌的荚膜染色法
二、实验原理
1 芽孢染色的原理:
细菌的芽孢具有厚而致密的壁。

透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。

芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色但一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。

所有的芽孢染色法都基于同一个原则；除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。

当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。

然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

2 鞭毛染色的原理:
细菌的鞭毛极细，直径一般为0.01～0.02μm，只有用电子显微镜才能观察到。

但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。

鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理、让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。

常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。

3 荚膜染色的原理:
荚膜是细菌分泌到菌体周围的一层黏液状物质,通常是多糖和多肽类物质. 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。

由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定。

以免荚膜皱缩变形。

三、实验器材
1菌种：培养24h的枯草杆菌（Bacillcus subtilis）、培养12-16h的变形杆菌斜面,培养3d的固氮菌。

2染色液和试剂：5％孔雀绿水溶液、番红水溶液, 鞭毛染色液A液与B液，蒸馏水，香柏油，显微镜擦拭液,绘图墨水或黑色素溶液．
3器材：酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。

四、实验方法
（一）芽孢染色：
1涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。

2晾干固定；待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过3次。

3 染色：
A 加染色液。

加5％孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片用试
管夹夹住，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽对开始计算时问，约维持４～５min。

加热过程中要随时交替添加染色液和蒸馏水，切勿让标本干涸（加热时温度不能太高）。

B 水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。

C 复染：用番红液染色２－３min。

D 水洗、晾干或吸干。

4镜捡：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽孢和菌体的形态。

结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。

（二）鞭毛染色
1制片：吸取少量蒸馏水滴在洁净玻片的一端，无菌操作在斜面上取菌少许，在蒸馏水中轻沾，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端。

用吸水纸吸去多余的菌液。

涂片放空气中自然干燥。

2染色：
1）滴加A液，染4～6min。

2）用蒸馏水充分洗净A液。

3）用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5～1.0min (加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸)。

4) 用蒸馏水洗，自然干燥。

3镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。

结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。

（三）荚膜染色：
1 制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。

2 推片：取一个清洁载玻片一端接触混合液，以30°角进行推片。

3 晾干：在空气中自然晾干。

4 镜检：先用低倍镜、再用高倍镜、油镜观察。

5 结果：背景黑色，菌体因折光不同显黑色或白色，在其周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。

五、实验报告
1绘出所观察菌种的芽孢和菌体的形态图．
2绘出细菌鞭毛的形态以及着生位置．
3绘出固氮菌的菌体和荚膜的形状。

六、思考题
1 用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?说明原因.
不能。

因为简单染色法没办法给芽孢着色，芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难芽孢染色一般是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。

2 用鞭毛染色法准确鉴定一株菌是否有鞭毛,要注意哪些环节?
染色液一定要新鲜，特别是硝酸银染色法中更是如此，A染液和B染液最好都现用现配，A液一般不能放置。

染色过程中的细节也应充分注意：①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。

②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。

③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。

④A染液染3～5min，其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则加B染液后，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。

⑤加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽，30～60s，染色效果较不加热为好。

⑥B染液染完后，用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。

3 荚膜染色为什么要用衬托染色法?
荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易被染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，把不着色且透明的荚膜衬托出来。

荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。