Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
A + GATCT A TCTAG
二、其他常用的工具修饰酶
• DNA聚合酶Ⅰ
• DNA聚合酶Ⅰ大片段
• 反转录酶
• T4DNA连接酶
• 碱性磷酸酶：去除5’端磷酸基团 • 末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)：将dNTP加到DNA 的3’-OH上；或进行同聚物加尾。 • Taq DNA聚合酶
DNA片段。
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载 体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基 因是要表达的，则要选择合适的表达载体。
三、DNA分子的体外连接
1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接
非配伍末端连接
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
• 重组DNA导入受体菌
• 重组体的筛选和鉴定
• 重组体的扩增、表达和其他研究
一、成片段，每一
片段都与一个载体分子拼接成重组体DNA，将所有重 组体DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子
克隆的混合体，这样一个混合体称为基因。一、限制性核酸内切酶一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水 解酶 特异核苷酸序列 ： 大多为 4~6 bp 回文对称（palindrome sequence） 5’GAATTC 3’ 5’GGATCC 3’ 3’CTTAAG 5’ 3’CCTAGG 5’ 1.分类： 根据酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及 与DNA结合和裂解的特异性，限制性内切酶可分为三 型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
λgt 系列（插入型，适用cDNA克隆）
charon系列
（三） 粘性质粒(cosmid)
粘性质粒(cosmid)：又称粘粒，由λDNA的cos区与质 粒构成，双链环状DNA，克隆容量：40～50kb。
（四）M13噬菌体
一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长6.5kb。
复制型M13可用作克隆载体。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G +GATCC CCTAG G
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GATCC G + G CCTAG
5.同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Southern印迹
目录
4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定 5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA
最大优点：产生单链DNA
为了便于克隆外源DNA片段，在野生型噬菌 体DNA的Ⅳ基因和Ⅱ基因之间插入一段lacDNA。包 括lac启动基因-操纵基因序列以及编码β -半乳糖 苷酶头145个氨基酸的序列，并插入了多克隆位点
序列。
M13mp系列包括M13mp2、M13mp10、M13mp18、 M13mp19等。
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体 目的基因 自连
载体自连
3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase) 的作 用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制 造出粘性末端，再进行粘端连接。
四、将重组体DNA分子导入宿主细胞
1、转化
2.命名
• Smith和Nathame命名原则（1973）
属名 + 种名 + 株名 + 流水号 举例： 流感噬血杆菌d株 （Haemophilus influengae d） Hind Ⅰ
Hind Ⅱ
Hind Ⅲ
5’AAGCTT 3’
Hind Ⅳ
3’TTCGAA 5’
3.识别和切割位点 回文结构 4～6 bp
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 出现两种末端 粘性末端 平头末端 粘端 平端
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端
粘端
4.同功异源酶： 来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
（二）λ噬菌体(λphage)
野生型λ噬菌体为双链线性DNA分子，两端各带12 个碱基的单链粘性末端。基因组分三个区域：左侧
区（含有包壳的病毒颗粒所需的全部基因）、中间
区（非必需区，但包含与重组有关的基因）、右侧 区（包含所有主要调控组分）。 系替换型载体，外源DNA：9 ～ 23kb 常用：EMBL 系列（置换型，适用基因组克隆）
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
二、表达载体
除具有克隆载体的性质外，还带有表达构件—转录 和翻译所需的DNA序列。 （一）大肠杆菌表达载体 含复制起始位点、抗性基因、克隆位点，可以导入大 肠杆菌。表达载体中含启动子、核糖体结合位点、克 隆位点、转录终止信号。 1.启动子： trp-lac(tac)启动子：由trp启动子加上lac操纵子 中的操纵基因、SD序列融合而成。 λ 噬菌体PL启动子：一种温度诱导的启动子。 T7噬菌体启动子：表达效率很高的启动子。组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
若克隆基因的表 达产物与宿主菌 的营养缺陷互补, 那么就可以利用 营养突变菌株进 行筛选,这就是 标志补救.
α 互 补 的 检 测
目录
2、免疫学方法
利用特异性抗体检测表达产物
鸡的β肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法
3、核酸杂交法筛选特定DNA
原 位 杂 交
目录
第二节
基因克隆的载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计
的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector)
为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽
链而特意设计的载体称为表达载体。
2.核糖体结合位点：SD序列
3.转录终止序列
(二)真核表达载体
真核表达载体至少要含两类序列： ①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复
制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因
标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的
大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制
繁殖得到足够使用的数量。
3、DEAE-葡聚糖法
4、脂质体介导基因转染
5、显微注射法
五、目的基因的筛选与鉴定
1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue)
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
λDNA
促进组氨酸合成
重组体
标 志 补 救
②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，
包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序
列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增
殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以 及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。
第三节 基因克隆的基本过程
• 制备目的基因和相关载体 • 目的基因与载体的连接
拷贝，或其表达产物。
基因工程：为实现基因克隆所采用的方法及其 相关的工作。
基 因 重 组 示 意 图
第一节 基因工程的工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端 cDNA合成 5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾 切除末端磷酸基
（五）病毒载体
人类遗传病和肿瘤的基因治疗研究中，常
用的病毒载体有反转录病毒、 腺病毒、腺相 关病毒、HSV病毒。可将外源基因导入受体细 胞，以达到纠正遗传缺陷或杀死肿瘤细胞的目 的。多数病毒载体已质粒化，病毒载体主要包 括病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子。
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
松弛控制型 (relaxed control)
在整个细胞周期中 随时都可进行复制 在细胞内一般在20 个以上, 甚至多达
数千个

克隆载体的的质粒应具备下列特点
分子量小，以容纳较大的外源DNA，有 较高的拷贝数； 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； 具有多个限制内切酶的单一酶切位点，称 为多克隆位点；便于外源基因插入。
第八章 基因工程与体外表达
克隆（clone） 无性繁殖 基因克隆(DNA重组、 DNA克隆、分子克隆): 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子 （复制子、重组体），继而通过转化或转染
宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细
胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子
盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq