农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系Steve Millam摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。

马铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。

转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。

本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。

基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。

将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱导/出芽系统。

用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。

这种转基因状态可以通过分子分析来证实。

马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。

1．介绍马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。

Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。

转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。

de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。

Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众多已使用的实验方案的基础。

各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。

目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。

在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。

第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatin riboside），并结合低浓度的生长素（通常是的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA））,以此促进外植体产生愈伤组织。

第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。

每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。

以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。

那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。

使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。

但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。

尽管马铃薯通常是四倍体，但也经常使用双单倍体品系进行转基因研究。

此外，野生的二倍体植株也用此方法进行转化。

虽然许多的初步报道都基于模式植物的研究，但转化成功的基因型的范围也在不断扩大。

在众多马铃薯品种中筛选具有转化潜力的品种的研究中，科学家发现了一个有意思的现象，即转化效率与转化潜力无关。

最近几年，马铃薯的研究重心将集中到转基因的发展，包括赋予抗病虫害能力，提升块茎质量，以及提升淀粉产量。

2．材料．植物材料马铃薯Desiree品种的试管苗（来自苏格兰农业科学局[SASA]，网址是或其他机构）确保最初使用的是脱毒苗。

脱毒苗可以选择用马铃薯发芽的块茎培育的试管苗，或者温室中长势相同的马铃薯植株。

．生长调节剂母液提前准备好充足的生长调节剂母液用于配制16×250mL的完全培养基。

母液先用过滤方式消毒，然后分装到无菌离心管中，并置于-20℃中保存，可以保存6个月。

1．萘乙酸（NAA）（Duchefa）：将20mg NAA溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的NAA母液。

NAA母液可于4℃保存6周。

2．赤霉素（GA3）（Duchefa）：将20mg GA3溶解到20mL 50%的乙醇（乙醇与蒸馏水的比例为1:1）中，配成1mg/mL的GA3母液。

GA3母液可于4℃保存6周。

3．米素核苷（ZNR）（Duchefa）：将20mg ZNR溶解到1mL 1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水定容至20mL，配成1mg/mL的ZNR母液。

ZNR母液可于-20℃保存6个月。

．抗生素母液1．头孢霉素（Claforan，Cefotaxime powder，Roussel，Uxbridge，England）：用蒸馏水配制125mg/mL头孢母液，并用过滤方式消毒。

母液可于-20℃保存6个月。

2．卡那霉素（Duchefa）：用蒸馏水配制50mg/mL卡那霉素母液，并用过滤方式消毒。

母液可于-20℃保存6个月。

3．利福平（Sigma）：用甲醇配制50mg/mL利福平母液，不需要过滤方式消毒。

母液可于-20℃保存6个月。

．培养基所有的培养基都准备了250mL，分装至Durand bottles中，并在121℃下高压蒸汽灭菌20分钟，同时对抗生素进行过滤消毒。

然后在超净工作台中，先将生长调节剂母液加入培养基中，再分装至10个9cm的培养皿中。

1. 植物生长必需培养基（BM）：1×MS基本培养基加上维生素混合物（Duchefaproduct ），20g/L蔗糖，用蒸馏水定容至1L，并调节pH至。

加入L的琼脂粉，经高压蒸汽灭菌后，于4℃保存。

2. MS20培养基：即液体BM培养基，成分和上面相同，但是不加琼脂粉。

3. 共培养基（CM）：在BM培养基中加入L的NAA，L的GA3，L的玉米素核苷（ZR），8g/L的琼脂粉。

4. 第一阶段再生培养基（CMC）：在CM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌）。

5. 第二阶段再生培养基（CMCK）：在BM培养基中加入L的NAA，L的GA3，2mg/L的玉米素核苷（ZR），500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。

6. 选择培养基（SM）：在BM培养基中加入500mg/L的头孢霉素（已用过滤方式灭菌），50mg/L的卡那霉素（已用过滤方式灭菌）。

7. LB培养基：10g/L的胰蛋白胨；10g/L的酵母提取物；10g/L的NaCl，pH= ；18g/L的琼脂粉。

．细菌菌株和载体1．农杆菌菌株LBA4404。

2．DNA构建体：pBIN19的双元载体衍生物。

载体通过电击转化进入LBA4404中。

成功转化的细菌能够选择性地在含有100mg/L的卡那霉素和利福平的LB培养基上生长。

农杆菌菌液需加入甘油，置于-80℃保存。

．其他物品和溶液1．灭菌剂：10%的Dmomestos（Lever Brothers，UK），其有效成分为%的次氯酸钠。

2．混合肥：爱尔兰苔藓腐殖土（bedding grade），1200L；Pavoir沙，100L；石灰石（magnesium），；石灰石（calcium），；sincrostart基肥（William Sinclair，Lincoln，UK），；Celcote湿润剂（LBS Horticulture，Lancashire，UK）,；珍珠石，100L；Osmocote控释肥（Scotts，UK），2kg；Intercept杀虫剂（Bayer），390g。

3．方法．培育试管苗所有的试管苗都置于18-22℃，16小时光照（光照强度为80-110μE/m2/s），8小时黑暗环境下培养。

用发芽的块茎培育试管苗1．将块茎上的芽切下，并用自来水冲洗。

2．先将切下的芽置于加有2滴吐温20的70%乙醇中浸泡1分钟，然后用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。

3．用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。

用温室中正在生长的植株培育试管苗1．选择生长旺盛，且未受到病虫害侵袭的植株，将其茎段和芽尖剪下，并立即用自来水冲洗。

2．先将茎段和芽尖剪成5至10mm的小段，然后用加有2滴吐温20的70%乙醇漂洗1分钟，接着用10%的Domestos浸泡15分钟，再用无菌水清洗5遍，最后放在BM培养基中培养。

3．用装有BM培养基的90mm培养皿或者组培瓶对茎段和芽尖进行继代培养。

．准备农杆菌1．从用甘油保存的菌液或者含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB平板培养基上挑取菌种，并置于5mL发酵培养基中活化。

2．将农杆菌加入5mL含有100mg/L卡那霉素和利福平的LB培养基中，然后放在摇床上，28℃，200rpm过夜培养。

3．过夜培养后，用250mL的锥形瓶将5mL的菌液转入50mL含有相应抗生素的LB培养基中，用相同的条件过夜培养。

4．过夜培养后，测量农杆菌悬浮液的光密度（OD）值为600nm。

5．将菌液加入无菌离心管中，700-1000g离心15分钟，然后用15mLMS20重悬沉淀。

6．同时，用650μL之前摇的菌液和350μL甘油混合，配成1mL菌液，用液氮速冻后，置于-80℃保存。

．接种、转化和再生1．从生长3-4周的马铃薯植株上截取长约10mm，切面直径不低于的节间部分。

2．将外植体（数量不低于30个）放在装有MS20培养基的平板中，避免干燥。

3．在90mm平板培养皿中加入15mLMS20培养基，再加入1mL之前摇的菌液，然后将外植体放入培养皿中，用封口膜密封，置于细菌恒温摇床中，22℃，50rpm转化45分钟。

4．将农杆菌悬浮液倒入容器中，并使农杆菌失活。

5．用无菌滤纸将外植体表面的水分吸干，然后置于CM培养基上（每个平板上放30个外植体）。

将平板密封后，在18-22℃，弱光处（光照强度为20μE/m2/s）转化48小时。

6．然后将转化好的外植体置于CMC培养基上进行共培养，每个平板上的外植体应低于10个。

将平板密封后，在18-22℃，充足光照处（光照强度为80-110μE/m2/s）培养。

7．12天后，将CMC培养基中的外植体转移到CMCK培养基中进行培养。

8．每14天更换一次新的CMCK培养基。

9．愈伤组织和丛生芽在4周后出现，然后继续培养。

当大约第三次换CMCK培养基时，小心剪下5-10mm左右的丛生芽，然后置于SM培养基中。

10．继续每14天转移一次外植体，同时剪下后长出丛生芽，确保每个芽发育成单独的植株。

．选择和进一步生长转基因的丛生芽1．在SM培养基中培养14天后，移出存活的苗（即那些仅从芽的伤口处长出根的苗）。

剪取10-15mm的芽尖，然后放在新的SM培养基中进行2次筛选。

2．那些从切口处生根的植株可以认为是已成功转化的。

接下来就可以将这些植株放在SM培养基上进行共培养，最后转移到温室中进行培养。

Fig. 1. (A) 培养6周后从5mm的Desiree外植体茎段长出的丛生芽。

照片的放大倍数为3倍。

(B) 将可能转化的芽切下，放在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上培养14天后，可以看到左边的小苗长出根，因此推断是阳性植株。