固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备 固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶 蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水 的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
2)、制备固定化酶遵循基本原则：
（1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （ 2 ）固定化应该有利于生产自动化、连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨 碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 （4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能 回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与 废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
共价键结合法
（2）所用载体
重氮化法：具有氨基的不溶性载体（R－NH2）。 以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。 多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃 烷 化 法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰纤 维素、碘乙酰纤维素） 含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）
共价键结合法
（3）固定化酶的制备机理
常用载体：硅胶、离子交换树脂。
交联法
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
优点:结合牢固,可以长时间使 用. 缺点:反应条件剧烈，酶活力损 失大，制备成的固定化酶颗粒 较小，使用不方便。
缺点： 单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防
治酶的失活和变性。
首先被采用包埋法的是：
• 固定化胰蛋白酶
第四章 酶的固定化
酶应用过程中的一些不足
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α -淀粉酶等； 和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在 高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容 易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样 酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后， 即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使 用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一 起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
四、酶的固定化方法
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的 方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于 结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括 为四种类型： 1.吸附法； 2.结合法； 3.交联法; 4.包埋法
1.吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含酶 菌体吸附在其表面上，而使酶固定化 的方法称为物理吸附法。
（2）固定化酶的制备机理
所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上。
（3）优缺点
优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的 高级结构;方法简单，成本低。 缺点：酶吸附不牢固，易脱落； 防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应
吸附法固定化酶举例
载体 固定化酶
α －淀粉酶、β －淀粉酶 蔗糖转化酶、葡萄糖淀粉酶 核糖核酸酶、木瓜蛋白酶 脂肪酶、葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
乙二醇、多元醇
聚异氰衍生物
聚胺、聚酯
三步：
1
A 乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不 溶于水的有机溶媒中充分乳化。
B 表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上 述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起 来形成微型胶囊球。 C 清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩 余单体。
微型胶囊法形成的固定化酶
亮氨酸氨肽酶 胰蛋白酶、核糖核酸酶 Β－淀粉液化酶
活性炭
多孔玻璃 氧化铝 碳酸钙凝胶 纤维素 麸素
硅胶
磷酸化酶
2.结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一 起的固定化方法称为结合法。 根据酶与载体结合的化学键不同，可分为共价结合法和离 子结合法。 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法 称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不 溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维 素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法 称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚 物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯 基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键， 必须首先使载体活化。
胶囊制法 囊膜的素材 尼龙 表面聚合法 应用的酶 乳糖酶 羧基脱氢酶
聚合脲
聚苯乙烯
天门冬酰胺酶
过氧化氢酶 脂肪酶 脲酶 过氧化氢酶 天门冬酰胺酶 天门冬酰胺酶
液中干燥法
相分离法 硝酸纤维素
火棉胶
微型胶囊法优缺点
优点： A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。
B 能很好地保存天然酶的活性和特性。 C 大小可任意调节，制备时间短。
4.包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。 载体：琼脂、海藻酸钠、明胶聚丙烯酰胺等 包埋法可分为凝胶包埋法和微胶囊法。 凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微
孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多 数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶 有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶 以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
制备的固定化酶
凝胶或膜 聚丙烯酰胺凝胶 酶 α、β－淀粉酶 葡萄糖氧化酶 乳酸脱氢酶 胆碱酯酶 青霉素酰胺酶
淀粉 琼脂
微型胶囊法
（1）原理 把酶包在超薄半透性 的聚合物膜中，制成 球状含酶微型胶囊。
特点
微囊直径几微米～几百微米。 低分子底物可以自由通过并进入微囊内。
与酶反应后的生成物被排除在微囊外，
（3）优缺点
优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构 和活性中心不易破坏，有利于制备高活性 酶 缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下 酶易从载体上脱落
第一个离子结合法固定化酶： DEAE-Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固， 可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈， 酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较 大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗 粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法 与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。
先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂 戊二醛与酶蛋白的氨基之间交联起来，形成酶网包围在 载体表面。
3.交联法
借助双功能试剂使酶分子间发生交联 作用,制成网状结构的固定化酶的方法 称为交联法。 常用的双功能试剂有：戊二醛、己二 胺等、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。 其中应用最广泛的是戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋 白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱， 而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定 化菌体。
微胶囊法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球
内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰 胺膜、火棉胶膜等。
包埋法
凝胶包埋法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）丙烯酰 胺氢气
固定化 酶
光照 切 割 聚合反应 凝胶酶块
酶液
N，N－ 双丙烯 酰胺
催化剂：四 甲基乙二胺 、明矾胺
引聚剂：
过硫酸钾、核黄素
三、酶的固定化方法原则和注意事项
1)、固定化酶操作的注意事项
活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的 氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合。 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
缺点：
1.由于多一步固定化操作，存在酶固定化过程中的活性收率损 失； 2.多了固定化载体成本费用及固定化操作费用，并且固定化酶 颗粒的扩散阻力作用会使酶的反应速率下降; 3.比较适用于水溶性的底物和小分子底物。