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分析内容 – 分子水平
• 外显子组测序
右图为Oncotest公司使用外 显子组测序结合生物信息学分 析方法整理出的 23 个 PDX 模型 中 507 个癌症相关基因的突变 频率。 每一个扇区代表了一种肿瘤 类型；热度图指示了该肿瘤类 型中某个基因的突变频率。
Krzywinsky, M. et al. Circos: an Information Aesthetic for Comparative Genomics, Genome Res (2009) 19:1639-1645
PDX模型的应用
• 分子标记物(Biomarker)的开发流程
Training Set
• 评估药物反应
• 分析分子生物学 特性 • 生物信息学/统计
Development
• 确认方法适用性
• 校准标记物表达 水平 • 确认检测方法相
Preclinical
• 根据生物标记物 设计相关的临床 实验 • 使用非临床实验
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分析内容 – 分子水平
• 蛋白表达（蛋白标记）
– 蛋白免疫印迹 Western Blot – 免疫组织化学染色 IHC – 荧光原位杂交 (FISH)
肝癌PDX模型的蛋白表达分析。 Hung Huynh, et al. Cancer Res 2006
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• PDX模型的建立
• PDX模型的分析 • PDX模型的应用
– 建立和维持的成本较高
• 相对的建成之后的使用价值也非常高
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• PDX模型的建立
• PDX模型的分析 • PDX模型的应用
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PDX模型的建立
• 关键点
– 肿瘤宿主 – 肿瘤接种 – 肿瘤的冻存和复苏
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宿主品系
小鼠品系
Nude SCID
Severe Combined Immunodeficiency
– – – – – 移植瘤生长时间 接种成功率 移植瘤遗传学特性 移植瘤组织学特性 移植瘤传代的稳定性
• 模型建立情况与肿瘤类型相关 • 荷瘤小鼠的饲养
• 设施要求（常规为SPF级IVC饲养） • 完善的IACUC政策
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肿瘤接种
• 皮下接种
Norman E. Sharpless and Ronald A. DePinho, et al. Nature Review Drug Discovery 2006
PDX模型和肿瘤病人有更好的对应性！
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使用PDX模型
• 劣势
– 仍然不能模拟肿瘤与免疫系统的交互
• 可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系统
– 在传代过程中模型的非肿瘤基质会被鼠源的基质逐 渐取代
• 使用较低代数的PDX模型进行研究
– 需要相对便捷的临床肿瘤样本来源 – 技术水平上有挑战性
• 移植 + 分析（包括生物信息学平台）
– 避免RNA酶污染，一般用试剂盒小心提取，冷冻保存 – 包含mRNA和miRNA
• 蛋白样本（组织裂解液）
– 处理时包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂 – 冷冻保存
生物样本库
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分析内容 – 常规
• 临床背景
– 患者年龄/性别； – 肿瘤类别，原位瘤/转移瘤； – 治疗史
• 移植瘤分析
– 生长曲线； – 药理学特性
Guido Sauter, et al. Nature Review Drug Discovery 2003 22
分析内容 – 分子水平
• DNA
– 基因序列
• 第二代测序平台：Illumina HiSeq等
– 基因突变
• Sequenom OncoCarta™ Panels V1-3
– V1：涵盖19个常规癌基因的238个突变位点 – V2：涵盖18个癌基因或癌抑制基因的152 个突变位点 – V3:：涵盖22个癌基因的105个突变位点
• 免疫组织化学染色 （IHC）
– 常规标记（如细胞增殖、凋亡） – 移植的生物标记物（Her2, EGFR, KRAS等蛋白） – 研究者感兴趣的蛋白
神经内分泌前列腺癌PDX模型维持了原瘤的蛋白标记
Dong Lin, et al. Cancer Res 2013 21
分析内容 – 组织学
• 组织芯片(Tissue Micro-Array , TMA)
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PDX模型的应用
• 新药开发和筛选
– 研究PDX模型对于药物处理的反应
• 分子标记物开发(Biomarker)
– 药物反应 分子生物学机制
• 个性化治疗
– 分子生物学机制 针对性的治疗方案
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PDX模型的应用
建立PDX模型进行生物标记物的开发来实验个性化治疗
Tentler, J. J. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. (2012) 30
人源肿瘤异种移植(PDX)模型的建立、 分析和应用
Fei Zhou
肿瘤研究模型
• 多样化的肿瘤研究模型
– 病人肿瘤组织/原代肿瘤细胞 – 永生化的肿瘤细胞系
• 2D和3D的细胞生物学实验方法（增殖/存活） • 来源于肿瘤细胞系的移植模型
– 来源于病人肿瘤组织的移植(PDX)模型 新 Patient Derived Tumor Xenograft
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分析内容 – 分子水平
• RNA
– 基因表达谱
• Affymetrix HG-U133 plus 2.0 Array
– 单核苷酸多态性(SNP)和拷贝数变异分析
• Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array V6.0
பைடு நூலகம்
– miRNA表达数据
• miRNA array
免疫缺陷
T淋巴细胞严重缺失 T淋巴细胞和B淋巴细胞缺失 与普通SCID相比NK细胞活性低， 更低的免疫恢复几率 缺失T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK 细胞
NOD-SCID NSG
Non-obese Diabetic SCID
NOD-SCID-IL2Rγ -/-
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宿主品系
• 目前并没有针对不同品系宿主的完整比较
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肿瘤接种
• 使用套针(Trochar)进行皮下肿瘤接种
Xiaomei Zhang, et al. Current Protocols in Mouse Biology 2013
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肿瘤接种
• 原位接种
– 常用途径：肾包膜下接种(Sub-Renal Capsule, SRC)
Peter Eirew, et al. Nature Protocols 2010
– 整理过的基因突变数据
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分析内容 – 分子水平
• 外显子组测序
– 外显子捕获
• Roche SeqCap EZ • Agilent SureSelect • Illumina TruSeq
– 使用第二代测序平台进行外显子组测序 – 需要有整合的生物信息学分析平台
• 针对PDX模型对二代测序结果分析进行优化 • 对识别变体的方法进行优化和验证 • 根据需要开发个性化的数据分析方法
• 针对特定药物处理的反应
• 组织学和分子生物学分析
– 原瘤 vs. 移植瘤
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分析内容 – 组织学
• 病理学染色（HE染色）
– 确认肿瘤组织结构
头颈癌PDX模型维持了原瘤的组织学特性
Peng et al. Journal of Translational Medicine 2013 20
分析内容 – 组织学
Validation
• 在PDX模型上测 试生物标记物 • 在临床实验中确 认药物作用
学分型
关参数和阈值
进行预试
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PDX模型的应用
Tentler, J. J. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. (2012) 32
谢谢！
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• PDX模型的分析 • PDX模型的应用
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PDX模型的分析
• 目的
• 说明移植瘤与原瘤的相似性 • 确认移植瘤在传代过程中的生物学稳定 • 为PDX模型的应用提供数据支撑
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需要保存的材料
• 基因组DNA
– 使用代表性的肿瘤组织区域进行DNA提取
– 如：排除坏死区域等
– 冷冻保存
• 总RNA
– 肿瘤的多样化和异质性 – 研究模型与临床病人缺乏相关性
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PDX模型技术流程图
Modified Fig from Oncodesign Biotechnology
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为什么使用PDX模型？
• 优势
– 没有体外培养的过程对肿瘤进行“筛选” – 能搞保持肿瘤原有特性和异质性 – 在传代过程中能够保持分子生物学水平的稳定 – 保留了原有的非肿瘤基质和微环境 – 可以对多种状态下病人来源的肿瘤进行研究
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肿瘤组织的冻存和复苏
• 冻存液
– 胎牛血清 + 10% DMSO
• 保存条件
– -80oC：6周 – 液氮：长期保存
• 从冻存条件下复苏
– 37oC水浴快速解冻
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肿瘤组织的冻存和复苏
• 通过冻存和复苏可以：
– 在获得患者知情同意书之前保存样本 – 保有备份样本进行重复实验
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• PDX模型的建立
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传统模型：肿瘤细胞系
• 可以很方便的在体外进行培养和实验 • 缺点：
– 在培养和传代过程中进行“筛选”，肿瘤细胞 逐渐适应体外培养环境而失去原有特性 – 缺乏肿瘤相关的生长环境
• 支持性的非肿瘤基质 • 血液细胞，免疫系统的交互 • 其他肿瘤微环境因子
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肿瘤研究模型