Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000 sequencing
工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解
决方案。
● 可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板
● 快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果
● 使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程
● 样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品
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Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
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10
真核mRNA的纯化
链霉亲合素包被磁珠+生物素标记 Oligo（dT）25+poly（A）
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1717
RNA-Seq (Transcriptome)
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18
Workflow of RNA-Seq(Transcriptome)
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200nt~700nt)
Random hexamer primed cDNA synthesis
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000 sequencing 101PE
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生物信息学分析
19
RNA-Seq (Transcriptome)
Technique
2
Characterize the transcriptome in unparalleled detail
7
检测报告-合格样品
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棉铃虫/果蝇
8
检测报告-不合格样品
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9
Workflow of RNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)
RNA-Seq mRNA
O
Small RNA 测序
Small RNA
O
降解组测序 mRNA
Non-coding RNA测序
Non-coding RNA
O
O
表达谱研究
O
O
O
O
基因结构分析
O/X
X
X
O
EST 测序
O/X
X
X
X
筛选分子标记
O
O
O
X
转录融合基因
表达
O/X
X
X
X
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5
Workflow of RNA-Seq
整理ppt
PCR
↓
PCR胶回收
15Workflow of NhomakorabeaNA-Seq
Total RNA
Eukaryon
Procaryon
Enrich mRNA by OligoT
Remove rRNA
RNA fragmentation (200bp)
Random hexamer primed cDNA synthesis
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mRNA的纯化主要通过的磁珠与 生物素吸附原理从而分离纯化
Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要 是mRNA的3′的poly A与磁珠在 bindingbuffer的作用下相结合。磁 珠通过MPC（磁分离器）从溶液 中分离出来。
mRNA与磁珠结合后，再用TrisHCL在加热条件下解离洗脱到溶 液中。
RT ds cDNA
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13
末端修复(防止自连） cDNA 3′末端加A Adapter连接
整理消化DNA
↓
mRNA的分离
↓
mRNA的打断
↓
cDNA的合成
末端修复
↓
3’端↓ 加A
↓
加接头↓胶回收质量检测： Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度llumina Sequencing 生物信息分析
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6
Total RNA样品检测
Agilent 2200 检测 OD260/280:1.8~2.2 RNA 28S:18S ≥ 1.0; RIN≥7
新型安捷伦2200 TapeStation 系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR
RNA测序技术原理及应用
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1
基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层次
遗传的中心法则
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2
什么是转录组？
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All transcripts
All mRNAs
3
RNA是解读基因组的关键
Genotype
Phenotype
DNA
Protein
RNA
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4
RNA 测序技术
测序技术 研究对象 鉴定新分子
Expression-profiling Alternative Splicing Fusion Gene SNP detection
RNA-Seq (单端测序---Quantification)
√ － － －
RNA-Seq (双端测序---Transcriptome)
√ √ √ √
HiSeq 2500
Size selection, then PCR amplification
HiSeq 2000llumina Sequencing 生物信息分析
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16
Applications of RNA-Seq
Application
11
原核mRNA的纯化
Ambion MICROExpress Kit
LNA扣锁型探针
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12
mRNA反转录---fragment+RT
纯化过的mRNA样品加入 1 µl的fragment buffer 70℃ 作用1.5min。
加入1µl的stop buffer终止 反应。
加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。