核酸和蛋白质分析技术
第一节

核酸分析技术
讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片
一、核 酸 电 泳
Biblioteka （一）DNA的凝胶电泳凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开， 能容纳相对大量的DNA


（5）primer
5’端增加碱基
①内切酶识别点：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG ↑保护bp 对PCR产物cloning有很大好处 便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同 EcoRI 1 BglII 2-3 XbaI 2-3 HindⅢ >3 BamHI 2-3 PstI >4 XhoI >4 NotI >10 如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆 ∵未切开，连接不上
理论 模板扩增30轮 1ng-----------1g 实际 模板扩增30轮 1ng-----------10g
（二）基本要素


1 Taq DNA聚合酶：
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 ①5’3’DNA聚合酶活性； ②无3’5’外切酶活性， 35轮0.25%错配，与原始模板有差别； 最适聚合酶 温度72℃，选择72℃延伸 半衰期：92.5℃ 130min 95℃ 40min 97.5℃ 5—6min 变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性

pfu DNA 聚合酶


耐热
5’3’DNA聚合酶活性

3’→5’外切酶活性 精确度：pfu >Taq 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果



¤
2 .引物
人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100l ◆设计原则： （1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同 3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5'————— 3' ——上游Primer ——下游Primer 负链 3'————— 5' 例如： IL-3正链 5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3' 负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5' 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3' 所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'
操作流程


（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）； （2）靶基因样品的制备；
靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5

（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似
封闭 预杂交 杂交 洗脱



（4）杂交信号的检测与结果的分析


（4）Primer 5’未端可修饰、突变:
修饰
如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果
突变：
AGCTCCATGACCCAG 5'CGCTCCATGACCCAG 3'


注意：绝不可以在3'端进行上述改造 ∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸


1. 2. 3. 4.
基因检测： 基因克隆化 DNA突变 DNA序列分析
四、基因芯片

利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究
背景资料
基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃 等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有 可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探 针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加样品 后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ） 就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧 光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的 表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分 析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯 片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。
第二节

蛋白质分析技术
讲述内容：
一、Western Blot 二、ELISA 三、免疫荧光技术 四、免疫组织化学技术 五、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术
一 Western Blot


1
原理：
将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤 维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体 进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标 记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段 时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适 合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异 性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特 异性蛋白的半定量。
注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套

不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：
1 2 3 4 5 DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液
（一）原理：
双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA －－－变性 ↓ 与一对寡核苷酸引物（5’， 3’）降低温度退火 DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火 ↓ 适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA －－延伸
↓
第二轮：变性—退火—延伸
呈指数增长
理论值：一轮一倍
10轮 103=1000倍 20轮 106 30 轮 109
三 PCR技术


PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作 为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的 多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增 产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增 倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学 奖； 目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。


琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成
PCR产物的琼脂 糖电泳
聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析
特殊的凝胶电泳

倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分 离分子量10～2000kb的DNA分子；
钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可 分离大于107bp的DNA分子

（二）RNA 电 泳
二 核酸杂交技术

（一）Southern Blot 原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记 物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检 的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有 点突变、扩增重排等。
Plasmid:lng
Chromosome:300-500ng 注意：
防止交叉污染
4.dNTP：
四种脱氧核苷酸，基本原料 终浓度：50M
注意：不稳定，保存时间长会失效
5.Mg2+
TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+
不同的酶需不同Mg2+ Taq：较少，Mg2+ 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度
（1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于Tm值：Tm↑退火T↑； Tm↓退火T↓ 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3）延伸： 500nt---1min 500nt－－3min 一般：40－60sec
（三）PCR技术的应用
激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析
基因芯片的应用

用于基因转录水平的检测、基因组分析 和后基因组研究
举例：美国斯坦福大学Davis等用，然后与热处理的T淋 巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片 段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基 因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证 实，其中3个是未报导的新基因。



（2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少Primer间互补序列
导致2个Primer形成dimer
一般不要超过3个互补bp 如：CCCATGC : : : : GGGTCTA ATGGAGTC : : : : TCAGTAAGC
用于核苷酸多态性的分析
琼脂糖凝胶电泳的基本过程

材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶