高产胞外蛋白酶菌株的选育生命科学学院生物科学0901班王亚云 2009044020119
摘要：采用养牛场中的土壤，设置培养基来筛选出具有产胞外蛋白酶的菌株。
以酪素培养基平板产生的透明圈的大小作为选择标记，经初筛选择出透明圈的直径/菌落直径大的菌株为出发菌株。
经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。
通过形态观察、生理生化试验进行鉴定：突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。
关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选；诱变；鉴定
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。
作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适宜性宽，被广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。
目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。
常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌如黑曲霉、根霉；碱性蛋白酶生产菌如地衣芽孢杆菌；中性蛋白酶生产菌如枯草芽孢杆菌。
本实验是研究从养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，以得到高产胞外蛋白酶菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤
1.1.2 培养基：
1.1.
2.1 筛选培养基：
酪素培养基
1.1.
2.2营养培养基：
肉汤培养基
1.1.
2.3鉴别性培养基
（1）淀粉培养基
（2）明胶培养基
（3）葡萄糖发酵培养基
（4）葡萄糖蛋白胨培养基
乳糖发酵培养基、柠檬酸盐培养基、半固体培养基、三糖铁培养基均为商品试剂，直接按比例加蒸馏水即可。
1.2 方法
1.2.1 菌种的筛选
1.2.1.1 培养基的配置及灭菌
按上述配置方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。
取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。
1.2.1.2 涂布分离
称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。
取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。
在酒精灯附近进行无菌操作，分别取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上，用涂布器进行涂布，每个浓度梯度下设置两个平板。
待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。
1.2.1.3 菌种的纯化
观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。
采用分区划线法在酪素平板上进行分离纯化，每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。
将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。
1.2.2 紫外线诱变育种
1.2.2.1 悬浮液的制备
在摇瓶培养营养肉汤中取出1mL放入离心管12000r离心2min,去上清，加入无菌水1mL，再离心，在重复3-4次至可得到以后步骤可用的足够的菌，在加入无菌水1mL,将12个Ep 管中的悬浮液加入平皿中混匀。
1.2.2.2 紫外诱变
取培养皿中溶液1mL，作为对照组，不做任何处理。
其他分别在紫外光下照射30'' ,1'30'' 和2'。
照射后分别取1mL按以下方法进行梯度稀释（注意此操作要在黑暗处进行）：
0：10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8
3''：10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6
1'：10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6
1'30''：10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6
2'：10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6
稀释完成后，取后三个梯度0.1mL进行涂布，每个梯度下涂布两个平皿。
涂布完成后置于30℃的培养箱中培养7d。
7d过后观察菌落中透明圈的大小，并计算出胞外蛋白酶菌株菌落数目。
1.2.3突变菌株的鉴定
1.2.3.1生理生化鉴定
配置鉴别性培养基并进行高压灭菌处理。
根据各鉴别培养基对所选育的菌种进行生理生化鉴定，如下表所示：
生理生化鉴定表
1.2.3.2突变菌株革兰氏染色
（1）取菌：在载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环取菌涂抹均匀；
（2）固定：拿载玻片在酒精灯附近，使干燥固定；
（3）初染：滴结晶紫1-2滴，染色1min；
（4）水洗：用蒸馏水将载玻片上的结晶紫冲洗干净；
（5）碘液媒染：滴碘液1-2滴，媒染1min ；
（6）水洗：用蒸馏水将载玻片上的碘液冲洗干净；
（7）脱色：用95%的乙醇脱色30s；
（8）复染：番红染色3min后水洗；
（9）干燥：放在通风处自然干燥，或放在酒精灯附近干燥；（10）镜检
2结果与分析
2.1菌株的分离与筛选
菌落透明圈直径与菌落直径比值表
经比较选择H/C比值大的为出发菌株:
2.2诱变育种后菌株的致死率
诱变育种后菌株的致死率与H/C表
致死曲线
（１）致死率：试验存在很大误差，这次致死率结果极不可靠，根本就不符合客观事实。
可能由于：没有重复性，随机误差不可避免；菌液没有混匀；培养条件的不适宜等。
（２）Ｈ／Ｃ：突变后Ｈ／Ｃ基本上呈现下降趋势，可能由于培养基不适宜突变后的菌株的良好生长。
2.3菌种的鉴定
2.3.1菌种的细胞形态
经革兰氏染色后，在显微镜下对其形态特征进行观察: 大肠杆菌此菌为两端钝圆的短小杆菌,无芽孢、革兰氏阳性;w1杆状，有芽孢、革兰氏阳性；金黄色葡萄球菌为球状、无芽胞、革兰氏染色阳性；w2杆状，无芽孢、革兰氏阴性。
2.3.2生理生化特征鉴定
生理生化鉴定结果表
菌株的选育是通过酪素培养基的平板上形成的透明圈直径与菌落直径的比值的大小选出来的，被认为是正变菌株筛选的有效手段。
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
八个培养基的鉴别试验中：乳糖发酵培养基和葡萄糖发酵培养基都放入了杜氏小管，是用来鉴定细菌是否发酵产生气体；淀粉水解培养基是倒平板、划线接种，观察是否产生透明圈；三糖铁培养基，底层为红色，斜面为红色，可能三种糖都不利用或者只利用葡萄糖，斜面和底层均为红色，利用葡萄糖和乳糖，或者利用葡萄糖和蔗糖，或者这三种糖都利用。
3 讨论
能分泌胞外蛋白酶的菌株可在酪素平板上形成肉眼可见的蛋白水解圈, 在对特定产酶菌株进行诱变时, 由于条件相对统一, 比较选择平板上形成的蛋白水解圈的大小被认为是正变菌株筛选的有效手段。
但因为蛋白水解圈是非选择性标记, 筛选工作量十分庞大, 人们也尝试采用其它易于选择的标记物如营养缺陷型、抗生素抗性等作为非直接选择措施, 以淘汰大量的没有发生突变的野生菌株。
本实验旨在了解微生物菌株选育的过程，由于过程不是很严密，因此鉴定不能准确鉴定到种。
本实验从河北农业大学西校区养牛场的土样中筛选两筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，得到高产胞外蛋白酶菌株。
并对其进行形态和生理生化确定为：突变菌株w1为芽孢杆菌属，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。
工业微生物菌种选育在发酵工业中占有主导地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及经济成本的关键。
我国的酶制剂工业经过40多年来几代人的努力，已具备一定的规模和水平，但总体来说与国际先进水平相比各方面都还有相当大的差距。
菌株的产酶力和酶的性能对降低成本，扩大市场有重要意义。
诱变育种是提高产酶力的重要手段，随着基因工程的普及，我国在纤维素酶和碱性蛋白酶的研究上也取得了很大成效。
近几年来，高通量筛选技术的确立使筛选效率得以大大提高，相信随着研究的深入和知识的积累今后也会有新的突破。
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