一、蛋白酶的分类、主要用途及作用二、产蛋白酶菌株的筛选三、产酶发酵四、蛋白酶活性测定的方法蛋白酶的分类、主要用途及作用酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子。

蛋白酶：水解蛋白质肽键的一类酶的总称蛋白酶分类：1据水解多肽的方式分为内肽酶和外肽酶2据反应的最适pH值分为酸性，碱性，中性蛋白酶蛋白酶简介：广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。

微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

催化蛋白质水解的酶种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。

蛋白酶对所作用的底物有严格的选择性，一种蛋白酶只能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。

蛋白酶分布广泛，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富，由于动植物资源有限，工业生产上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌等微生物发酵设备。

一、酸性蛋白酶定义：酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类注：酸性蛋白酶是指蛋白酶具有较低的最适pH,不是指酸性基团存在于酶的活性部位.简介：主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。

根据其产菌的不同，微生物酸性蛋白酶可以分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶，根据作用方式可以分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要的产酶微生物是曲霉、青霉和根酶等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛酶和栗疫酶等，从酶的活力-PH曲线分析,在酶的活性部位中含有一个或更多的羧基，这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。

酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。

基本性质酸性蛋白酶的最适PH从2左右(胃蛋白酶)到4左右应用1酿酒：酸性蛋白酶在酿酒的过程中起协同作用，具有溶解发酵原料，促进微生物繁殖，降解酵母菌体蛋白等多种功能。

2毛用酸性蛋白酶最适ph3.5，最适温度40度，用该酶处理预处理后的羊毛，可以得到较大的减量率和较好的细度。

面临的问题：酶对羊毛的作用活力不高。

3食品工业：食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量4啤酒生产：能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。

饲料添加剂：提高饲料利用率。

二、碱性蛋白酶简介碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。

碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。

基本性质适宜于在40-55℃、PH9-11的碱性条件下使用，超出以上范围酶的活力下降。

重金属离子和阳离子表面活性剂对其活力有抑制作用，应用中应避免。

应用碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果。

二、中性蛋白酶简介中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。

在一定温度、PH值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。

可广泛应用于动植物蛋白的水解基本性质水解温度 35 ～55 ℃ PH 值： 6.0 ～ 7.5应用1动植物蛋白水解粉（HAP、HVP）生产的应用利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，其水解液AN%高，水解度高，风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂，各种动物来源性抽提物生产功能性骨、肉提取物（骨素）、水产提取物、蛋白胨、肽等及研究开发一些高附加值的功能食品。

2焙烤行业的应用：中性蛋白酶可将面团的蛋白质水解成胨、肽类甚至氨基酸，从而减弱面团筋力，使它具有良好的可塑性和延伸性，保持清晰美观的印花图案。

改善成品的光泽、使饼干断面层次分明，结构均匀一致，口感松爽酥脆。

3大豆分离蛋白的应用：能水解大豆分离蛋白成小分子肽，大大提高了大豆分离蛋白的生物效价，使其易为人体消化吸收，同时还提高了溶解，降低了粘度，改善了大豆分离蛋白的功能特性。

4酵母抽提物、酵母浸膏的生产应用提高最终产品的蛋白质利用率及风味5啤酒工业：添加中性蛋白酶分解蛋白质为多肽和游离氨基氮，特别对大麦，大豆等植物性蛋白作用效果明显，用于啤酒生产，可排除蛋白质产生的"冷混浊"现象。

6医药工业的应用：含中性蛋白酶的药物，可起到消炎、利胆、止痛、助消化的功效。

7纺织工业的应用：用中性蛋白酶处理过的羊毛，其抗张度比常规方法高，毛线手感柔软，收缩性为0；还可用于蚕的脱胶和蚕丝的精炼。

8皮革工业的应用：利用中性蛋白酶可制成脱毛剂，经鞣制的皮革，脱毛干净，粒而清晰，无明显损伤，毛孔细致光亮。

9饲料工业的应用：加入饲料配方中或直接与混合饲料混合饲喂，可提高蛋白质的利用率和降低饲养成本。

产蛋白酶菌株的筛选方法一（形成芽孢产蛋白酶菌株的筛选）实验方案设计一、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。

枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。

由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。

但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。

例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。

又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。

1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。

由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。

2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。

利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。

根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。

3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。

有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。

菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。

在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。

菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。

4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚、H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。

葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。

二、实验材料及用具（1）肉汤培养基：组成：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，煮沸后调节ph7.2-7.4，121度高压灭菌15min。

.配置100ml，其中20 mL液体培养基放入250 mL锥形瓶中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。

（2）酪素培养基：组成：蛋白胨10 g，葡萄糖1 g，氯化钠5 g，氯化钙0．1 g，L-酪氨酸0．1 g，琼脂22 g，酪素5 g，蒸馏水1 000mL，pH 7．2～7．4，112℃ ，灭菌30 min．200 mL放入500 mL的锥形瓶中，6个平板，pH 6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。

(3) 生理盐水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支(4) 其他：平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250mL，500 mL规格）、革兰氏染色液等。

三、实验步骤1.采样从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样。

2.增殖培养（富集培养）取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。

然后30℃，150 r/min，振荡培养24h。

取样镜检形成芽孢的情况。

3. 涂布分离将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。

然后取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。

分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。

观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。

4. 纯化用平板划线分离法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分离纯化挑选出的菌株。

5. 纯种鉴定菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。

①细胞形态，菌落特征，芽孢形成情况。

②产蛋白酶能力的测定：直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈。

6.菌种保藏该实验分离得到的枯草芽孢杆菌作为后续实验的菌种使方法二（利用蛋白水解圈）一实验原理通过样品采集、富集培养、浓度稀释、涂布培养、传代培养和鉴定来分离产蛋白酶的菌株。

为了得到含有较多所需菌株的样品，采集样品时要在含有枯叶草根等土壤肥沃的地方采集。

通过富集培养使能产生蛋白酶的菌株数量增加，比例增大，利用显微计数法计数，稀释到合适的浓度，使其涂布培养后长成单个菌落，然后进行传代培养，再进行鉴定，在鉴定时为了菌株不受污染，利用影印平板法将菌株接种到两个平板的对应位置，一个平板用来接种到试管中，另一个平板用来检验。

Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，检验时将福林试剂滴到菌落上，若菌落周围出现透明圈，则说明菌落周围的蛋白质被细菌分解了，细菌产生了蛋白酶。

本实验含有一个对照，即培养基不接菌种的平板，该对照若无杂菌生长，则说明在这种培养基长出的菌落是所接中的细菌生长的.自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。