实验一多酚氧化酶活性测定（3学时）一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性二、实验原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。

醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。

三、器材与试剂低温离心机、s22pc分光光度计、儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液四、实验内容：1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。

4℃ 4000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。

2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。

3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。

4．计算酶活力。

按下式计算PPO活性＝U/min gFWA值增加0.001定义为一个酶活力单位。

五、实验报告：计算所测材料的PPO活性。

选择A值变化均匀的三组数值求平均值。

实验二植物耐盐生理指标测定（9学时）一、实验目的：1、了解盐胁迫的机理以及植物的耐盐机制2、了解植物盐处理的方法3、掌握植物体内脯氨酸含量测定的原理和方法4、掌握过氧化物酶活性的测定原理和方法5、掌握丙二醛含量的测定方法6、掌握基本的数据统计方法二、实验原理植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势, 维持植物体内的水分平衡, 保证植物的正常生长。

脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。

在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除植物体内多余的活性氧。

过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。

在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。

植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。

丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。

但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

三、实验主要仪器和试剂仪器: 离心机；分光光度计；恒温水浴锅试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3％磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10％TCA；0.6％TBA四、实验步骤（一）实验材料的培养小麦种子吸胀8h后消毒、4℃下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。

（二）盐胁迫处理用200 mmol/L NaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复3次。

（三）脯氨酸含量测定1.标准曲线的制作用100μg/ml脯氨酸配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μg/ml的标准溶液。

取标准溶液各2ml,加2ml3% 磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5% 茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A 值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。

2.脯氨酸的提取称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10min，冷却后，4000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。

3.反应体系取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。

以2ml磺基水杨酸，1ml 冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。

在可见分光光度计下520nm处测得A值。

4. 脯氨酸的含量的计算从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（μg/g）。

（四）过氧化物酶活性的测定1.过氧化物酶的提取称取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加5ml pH 6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02g PVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。

4℃，4000rpm离心15分钟，上清液为酶粗提取液2.反应体系25μl酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入后立即记时，每隔20s记一次数值，连续记录三次，取平均值。

3.酶活力定义过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在470nm下A值的变化值，设每变化0.01A为一个酶活力单位。

过氧化物酶活性=U/min·g（五）丙二醛含量测定1.丙二醛提取小麦叶片0.2g（每个处理设3个重复），加入10﹪三氯乙酸(TCA)5mL(分两次加)和少量石英砂充分研磨，匀浆液以4000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。

2.反应体系取2mL提取液，分别加入2mL 0.6﹪TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。

取上清液测定532nm和450nm下的A值。

以2mL水代替提取液调零。

3.MDA含量计算：根据C＝6.45×A532－0.56×A450，计算出样品提取液中丙二醛的浓度C，然后再计算出每克样品中丙二醛的含量(μmol/g（FW)）。

五、思考问题1.为什么设定重复处理？2.分光光度法要求A值在多大范围内，数据才可靠，如何调整？六、实验报告主要内容包括：1.实验目的及要求 2.实验主要仪器和试剂 3.实验原理 4.实验步骤 5.实验结果 6.结果分析 7.回答问题实验三植物的元素缺乏症——砂培法（3学时）一、实验目的：熟悉植物营养缺乏症的典型症状，熟悉砂培法。

二、实验原理：除了水分，植物还需要各种矿质元素来维持正常的生理活动。

缺乏矿质元素植物就不能很好的生长，同时还会表现出相应的症状。

应用砂培法可以观察矿质元素对植物生活的必需性，并避免土壤里的各种复杂因素。

三、器材与试剂：塑料盆、大烧杯、量筒试剂见实验指导四、实验内容：1．按照实验指导表格配制各种缺素培养液。

配制时，先取蒸馏水900毫升，然后加入贮备液，最后配成1000毫升，调pH 6.0。

2．将细砂洗净，装入干净的塑料盆内，然后选择长势一致的小麦或玉米幼苗（去掉胚乳）进行移栽，均匀栽种，每盆8－10株。

浇灌相应的培养液，贴标签。

3．2－3周后观察结果，记录小麦植株的生长状况。

（期间要及时更换培养液）五、实验报告：记录小麦缺素培养的症状，并进行分析。

实验四根系活力测定（3学时）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。

本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。

一、实验目的：掌握测定根系活力的方法及原理。

二、实验原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。

所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。

三、材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培或砂培小麦根系。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子天平；3. 恒温水浴锅；4. 研钵；5.离心机（三）试剂：1. 乙醇（分析纯）。

2. 次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。

3.1％TTC溶液。

4. 磷酸缓冲液（1／15mol/L，pH7）。

5. 1mol/L硫酸。

四、实验步骤（1）TTC标准曲线的制作取0.4％TTC溶液0.25ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。

再用乙醇定容至刻度，摇匀。

然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙醇定容至刻度，即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）称取根尖样品0.2g，放入10ml试管中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。

（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。

（3）把根取出，吸干水分后与乙醇10ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲腙。

3000rpm，15min，上清在分光光度计波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。

五、结果计算四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)]实验五 GA、NAA对植物生长的影响（3学时）一、实验目的了解不同的植物激素对植物生长的影响。

二、实验原理GA和NAA都能促进植物的伸长生长，但二者的作用有所区别，GA能够促进完整植株的伸长生长，而NAA则不能，只能促进离体组织如茎段、胚芽鞘的伸长。

三、器材与试剂：塑料盆、大烧杯、GA3（200mg/L）、NAA（200mg/L）四、实验内容1．将培养介质装入干净的塑料盆内。

2．各取30株高度一致的小麦，分为3组，去掉胚乳，分别浸入蒸馏水、GA3（200mg/L）和NAA（200mg/L）中，然后移栽到塑料盆内。

3．3－4周观察不同处理小麦植株的伸长状况。

五、实验报告列表比较各个处理的平均株高。

实验六乙烯对果实的催熟作用（3学时）一、实验目的：了解乙烯对果实的催熟作用；了解乙烯利的作用机理二、原理：乙烯是植物正常代谢的产物，是植物体内的一种内源激素，能够增加质膜透性，加速呼吸，引起有机物质强烈转化，进而促进果实成熟。

而乙烯利是一种人工合成的植物激素，pH>4.1时，分解释放乙烯，而植物细胞液pH一般在5.0－6.0左右。