文章编号（Article ID）：1009－2137（2012）02－0376－05·论著·巴曲亭及其有效成分对出血性疾病患者凝血功能的影响王瑞娟，王兆钺*，江明华，张威，曹丽娟，孙雄华，张剑，白霞，阮长耿苏州大学附属第一医院、江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室，江苏苏州215006摘要本研究旨在观察巴曲亭及其有效成分的止血机理及对出血性疾病凝血功能的影响。
采用全自动血凝仪检测巴曲亭及其有效成分巴曲酶与凝血因子Ⅹ激活物（FⅩA）对正常人及出血性疾病患者血浆的活化部分凝血活酶时间（APTT）与凝血酶原时间（PT）的影响，用发色底物法检测FⅩA、巴曲酶及巴曲亭对凝血因子Ⅹ（FⅩ）活化及凝血酶生成的影响。
结果表明：巴曲亭及其有效成分可以缩短正常人血浆的APTT，其中FⅩA缩短APTT的作用在一定浓度范围内存在量效关系（r=0．889，P＜0．05）。
FⅩA、巴曲酶及巴曲亭可纠正出血性疾病患者APTT 的延长，三者对PT无明显影响。
FⅩA能促进FⅩ的活化及凝血酶的生成，巴曲酶及巴曲亭对二者无明显作用。
结论：巴曲亭有明显的促进凝血效果，并可纠正出血性疾病的止血异常，其有效成分巴曲酶直接作用于纤维蛋白原，而FⅩA通过活化FⅩ促使凝血酶的生成。
关键词巴曲亭；凝血作用；出血性疾病中图分类号R554文献标识码Ain vitro Effects of Hemocoagulase Atrix and Its Effective Components on Blood Coagulation of Patients with Bleeding DisordersWANG Rui-Juan，WANG Zhao-Yue*，JIANG Ming-Hua，ZHANG Wei，CAO Li-Juan，SUN Xiong-Hua，ZHANG Jian，BAI Xia，RUAN Chang-GengKey Laboratory of Thrombosis and Hemostasis Subordinated to Ministry of Health，Jiangsu Institute of Hematology，The First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou215006，Jiangsu Province，China*Corresponding Author：WANG Zhao-Yue，Professor．Tel：（0512）67780872．E-mail：zwang11@sina．comAbstract This study was aimed to investigate the procoagulation effects of hemocoagulase atrix and its effective components（batroxobin and factorⅩactivator）on plasma of normal subjects and patients with bleeding disorders and their mechanisms．Activated partial thromboplastin time（APTT）and prothrombin time（PT）were measured．The factor（F）Ⅹactivation and thrombin generation were analyzed by using chromogenic substrate method．The results showed that the plasma APTT of normal subjects was shortened by hemocoagulase atrix，batroxobin and FⅩactivator，and the effect of FⅩactivator was found to be concentration-dependent（r=0．889，P＜0．05）．The prolonged APTT of plasma from patients with bleeding disorders could be corrected by hemocoagulase atrix，batroxobin and FⅩactivator，but PT showed no great changes resulted from the treatments．FⅩactivator could promote FⅩactivation and thrombin generation，while neither hemocoagulase atrix nor batroxobin showed such abilities．It is concluded that hemocoagulase atrix promotes coagulation process，and corrects coagulation abnormalities in patients with bleeding disorders，its main component batroxobin directly acts on fibrinogen，and FⅩactivator promotes thrombin generation through activating FⅩ．Key words hemocoagulase atrix；coagulation；bleeding disorderJ Exp Hematol2012；20（2）：376－380凝血过程是由一系列的丝氨酸蛋白酶及其辅因子参与的网络酶促放大反应。
组织因子（tissue factor，TF）表达于受损伤或受刺激的细胞（内皮细胞或单核细胞），与循环中的凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，FⅦ）结合形成FⅦ-TF复合物，激活FⅨ与FⅩ，使凝血酶原变为凝血酶，后者通过内源性凝血途径的正反馈作用，将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。
出血是一种常见的临床表现，外伤、手术及一些出血性疾病常常引起大量出血，甚至威胁到患者的生命。
蛇毒中含有许多不同生物活性的酶类，有些酶类作用于血液凝固酶促级联反应过基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号81070395）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）*通讯作者：王兆钺，教授，博士生导师．电话：（0512）67780872．E-mail：zwang11@sina．com2011－10－25收稿；2011－11－04接受·673·中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2012；20（2）：376－380程中的一个或多个环节，可激活FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ或直接使纤维蛋白原凝集［1－8］。
很多蛇毒成分已用于出血或血栓性疾病的诊断和治疗［9，10］。
蛇毒类凝血酶（thrombin-like enzyme，TLE）为丝氨酸蛋白酶，是蝮亚科蛇毒中一个具有促凝血活性的组成成分，能直接作用于纤维蛋白原，促进血液凝固［8］。
不同来源的蛇毒类凝血酶对血浆纤维蛋白原的作用方式不同。
根据类凝血酶作用于纤维蛋白原所得产物不同将其分为3类：①只释放纤维蛋白肽A，即SVTLE-A，如巴曲酶（bathroxobin）；②只释放纤维蛋白肽B，即SVTLE-B，如铜头蝮蛇毒类凝血酶（trimeresu-rus okinavensis）；③既释放纤维蛋白肽A又释放纤维蛋白肽B，即SVTLE-AB，如巴西窝面蝰蛇毒（B．jararacussu venom）［11］。
巴曲亭（hemo-coagulase atrix，注射用蛇毒血凝酶）为巴西矛头蝮蛇（Bothrops atrox）毒液中分离出来的止血成分，包括2种有效成分：巴曲酶和少量FⅩ激活物（FⅩactivator，FⅩA）。
巴曲酶直接作用于纤维蛋白原Aα链Arg16-Gly17处，释放纤维蛋白肽A后形成纤维蛋白单体Ⅰ，但不降解纤维蛋白B肽，亦不直接激活FⅩⅢ，因此不能形成稳定的纤维蛋白。
FⅩA可以直接激活FⅩ，从而激活凝血酶原，使纤维蛋白原降解成纤维蛋白，并激活FⅩⅢ，形成稳定的纤维蛋白。
巴曲亭已广泛用于神经外科、妇科与骨科手术，以及消化道与呼吸道出血，临床上有较满意的止血效果［12－15］，但有关实验研究资料较少，至今尚无对出血性疾病的治疗方面的实验研究。
材料和方法实验对象根据知情同意原则，留取20名健康志愿者（年龄20－45岁，男女各半）的3．8%柠檬酸钠抗凝血浆。
血友病A患者25例，维生素K依赖性凝血因子缺乏症患者7例，血管性血友病（von Willebrand disease，vWD）患者3例，FⅩ缺乏症患者3例，血友病B、FⅤ缺乏症、FⅦ缺乏症与纤维蛋白原缺乏症患者各1例。
血浆分装后在－20ħ条件下保存备用。
主要试剂及仪器巴曲亭（产品批号1003172）、巴曲酶与FⅩA由蓬莱诺康药业有限公司提供；人血浆FⅩ为Calbiochem公司产品；发色底物S-2337、S-2222为美国Sigma公司产品；活化FⅩ（FⅩa）标准品及人凝血酶标准品为Hyphen BioMed公司产品。
STAGO COMPACT全自动血凝仪为法国Stago公司产品，全波长多功能酶标仪为赛墨飞世尔科技实验室产品，KDC-40低速离心机为北京东南仪诚实验室设备有限公司产品。
活化部分凝血活酶时间（APTT）与凝血酶原时间（PT）检测在正常人血浆及出血性疾病患者血浆中分别加入一定浓度的FⅩA、巴曲酶或巴曲亭，37ħ温育3min 后在全自动血凝仪上检测APTT和PT，并与空白对照组（加入等量生理盐水）比较（APTT参考值范围为28－40s，PT参考值范围为11－14．5s。
）血浆FⅩ活化及凝血酶生成的发色底物法检测S-2337和S-2238分别为FⅩa及凝血酶特异性发色底物，被水解后释放出生色基团对硝基苯胺，后者的释放量与FⅩa及凝血酶的活力成正比，在405nm 波长处检测吸收峰。
取血浆或FⅩ（8μg/ml）100μl，加入100μl FⅩA溶液〔FⅩA0．002U/ml，Tris-HCl100mmol/L （pH7．5），CaCl26mmol/L，盐酸苯甲醚2mmol/L〕，37ħ温育5min，吸取100μl加入96孔酶标板中，再加入100μl发色底物缓冲液〔S-23370．625mg/ ml，Tris-HCl0．5mmol/L（pH8．3），EDTA25 mmol/L，NaCl375mmol/L〕，在405nm波长处检测其吸光度值30min［16］。