吸光光度分析法大纲要求：1.掌握吸光光度分析法的特点、基本原理、测定方法和计算方法；2.理解物质对光的选择性吸收和光吸收曲线；3.掌握朗伯一比耳定律的应用及摩尔吸光系数，了解引起偏离朗伯一比耳定律的原因；4.了解分光光度计的主要部件，各部件的作用及仪器的工作原理；5.了解显色反应的特点，掌握显色条件的选择；6.掌握分光光度法的应用和测量条件的选择。

基本内容：一、吸光光度分析概述基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法，可见分光光度法及紫外分光光度法等。

有些物质的溶液是有色的，若物质的溶液本身是无色或浅色的，但它们与某些试剂发生反后生成有色物质。

有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深。

如果是通过与标准色阶比较颜色深浅的方法确定溶液中有色物质的含量，则称为目视比色法，如果是使用分光光度计，利用溶液对单色光的吸收程度确定物质含量，则称为分光光度法。

吸光光度法主要用于测定试样中的微量组分，具有以下特点：a.灵敏度高。

常可不经富集用于测定质量分数为10-2～10-5的微量组分，甚至可测定低至质量分数为10-6～10-8的痕量组分。

通常所测试的浓度下限达10-5～10-6mol·L-1。

b.准确度高。

一般目视比色法的相对误差为5%～10%，分光光度法为2%～5%。

c.应用广泛。

几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用分光光度法进行测定。

d.仪器简单、操作方便、快速。

二、吸光光度分析的基本原理1、光的基本性质光是一种电磁波，同时具有波动性和微粒性。

我们将眼睛能够感觉到的那一段的光称为可见光，也就是我们日常所组合而成的复合光(即由不同波长的光所组成的光)。

理论上，将仅具有某一波长的光称为单色光，单色光由具有相同能量的光子所组成，两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合也可得到白光。

这两种单色光称为互补色，如图9.１所示，图中处于对角线上的两种单色光为互补色光。

例如绿色光和紫色互补，黄色光和蓝色光互补等。

2、物质的颜色和物质对光的选择性吸收颜色是物质对不同波长光的吸收特性表现在人视觉上所产生的反如果把不同颜色的物体放在暗处，什么颜色也看不到。

当光束照射到物体上时，由于不同物质对于不同波长的光的吸收、透射、反射、折射的程度不同而呈现不同的颜色。

溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点(离子或分子)对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。

当白光通过某一有色溶液时，该溶液会选择性地吸收某些波长的色光而让那些未被吸收的色光透射过去即溶液呈现透射光的颜色，亦即呈现的是它吸收光的互补色光的颜色。

3、光吸收曲线当依次将各种波长的单色光通过某一有色溶液，测量每一波长下有色溶液对该波长光的吸收程度(吸光度A)，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为该溶液的吸收曲线，亦称为吸收光谱。

图9.2是四种浓度KMnO4溶液的吸收曲线。

从图可见：①同一溶液对不同波长的光的吸收程度不同。

如：KMnO4对绿色光区中525nm的光吸收程度最大,此波长称为最大吸收波长，以λmax或λ最大表以，KMnO 4溶液呈现紫红色。

②不同浓度的KMnO4溶液的光吸收曲线形状相似，不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长均不相同。

光吸收曲线与物质特性有关，故据此可作为物质定性分析的依据。

③同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随溶液的浓度的增加而增大。

这个特性可作为物质定量分析的依据。

在测定时，只有在λmax 处测定吸光度，其灵敏度最高，因此，吸收曲线是吸光光度法中选择测量波长的依据。

三、吸光光度分析的基本定律1、朗伯—比耳定律如果同时考虑溶液浓度与液层厚度对光吸收程度的影响，将朗伯定律与比耳定律结合起来，则可得 lgI I 0=Kbc该式称为朗伯—比耳定律的数学表达式。

上述各式中I 0，I 分别为入射光强度和透射光强度；b 为光通过的液层厚度(cm)；c 为吸光物质的浓度(mol ·L -1)；k 1，k 2和K 均为比例常数，与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。

溶液对光的吸收程度lg I I与吸光物质的浓度和光通过的液层厚度的乘积成正比。

应用该定律时，应注意：(1)朗伯-比耳定律不仅适用于有色溶液，也可适用于其他均匀非散射的吸光物质(包括液体、气体和固体)；(2)该定律应用于单色光，既适用于可见光，也适用于红外光和紫外光，是各类吸光光度法的定量依据；(3)吸光度具有加和性，是指溶液的总吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。

根据这一规律，可以进行多组分的测定及某些化学反应平衡常数的测定。

这个性质对于理解吸光光度法的实验操作和应用都有着极其重要的意义。

2、吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸光系数上式中的lgI I项表明了溶液对光的吸收程度，定义为吸光度，并用符号A 表示；同时，I 0/I 是透射光强度与入射光强度之比，表示了入射光透过溶液的程度，称为透光度(以%表示，为透光率)，以T 表示，所以上式又可表示为： A = lgI I 0= lg T 1=Kbc式中的比例常数K 值随c ，b 所用单位不同而不同。

如果液层厚度b 的单位为cm ，浓度c 的单位为g ·L -1，K 用a 表示，a 称为吸光系数，其单位是L ·g -1·cm -1，则上式写为：A =abc如果液层厚度b 的单位仍为cm ，但浓度c 的单位为mol ·L -1，则常数K 用ε表示，ε称为摩尔吸光系数，其单位是L ·mol -1·cm -1,此时朗伯—比耳定律写为： A =εbc吸光系数a 和摩尔吸光系数ε是吸光物质在一定条件、一定波长和溶剂情况下的特征常数。

同一物质与不同显色剂反应，生成不同的有色化合物时具有不同的ε值，同一化合物在不同波长处的ε也可能不同。

在最大吸收波长处的摩尔吸光系数，常以εmax 表示。

ε值越大，表示该有色物质对入射光的吸收能力越强，显色反应越灵敏。

所以，可根据不同显色剂与待测组分形成有色化合物的ε值的大小，比较它们对测定该组分的灵敏度。

四、吸光光度分析方法及仪器㈠、分光光度计及其基本部分分光光度计通常由下列五个基本部件组成：㈡、测定方法1、比较法 比较法是先配制与被测试液浓度相近的标准溶液cs 被测试液cx ,在相同条件下显色后，测其相应的吸光度为A s 和A x ，根据朗伯—比耳定律： A s =εs b x c ； A x =εx b s c两式相比得：x s A A =x bc bc s εε 则得： x c =s xA A s c应当注意，利用上式进行计算时，只有当x c 与s c 相近时，否则将有较大误差。

b ．标准曲线法 测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制标准曲线，然后根据被测试液的吸光度，从标准曲线上查得而且误差较小。

五、显色反应及其条件的选择1、显色反应测定某种物质时，如果待测物质本身有较深的颜色，就可以进行直接测定，但大多数待测物质是无色或很浅的颜色，故需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂。

显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，当同一组分可与多种显色剂反应生成不同的有色化合物。

选用哪一种显色反应呢？对显色反应的选择，有下列考虑：a.首先是选择灵敏度高，即摩尔吸光系数大的反应。

但是，在分析化学中接触到的试样大多是成分复杂的物质，必须认真考虑共存组分的干扰，即希望显色反应的选择性好，干扰少。

需要指出的是，在满足测定灵敏度的前提下，选择性的好坏常常成为选择显色反应的主要依据。

b.有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。

对于形成不同配位比的配位反应，必须注意控制实验条件，使其生成一定组成的配合物，以免引起误差。

c.有色化合物的化学性质应足够稳定，至少保证在测量过程中溶液如日光照射、空气中的氧和二氧化碳的作用等，此外，也不应受溶液中其他化学因素的影响。

d.有色化合物与显色剂的关系差别要大，即显色剂对光的吸收与配合物的吸收有明显区别，一般要求两者的吸收峰波长之差△λ(称为对比度)大于60nm。

2、显色条件的选择确定了显色反应以后，还要确定合适的反应条件，这一般是通过实验研究来确定的：⑴、反应体系的酸度对某种显色体系，最适宜的pH范围与显色剂、待测元素及共存组分的性质有关。

目前，仍然是通过实验来确定。

其方法是保持其它实验条件相同，分别测定不同pH条件下显色溶液和空白溶液相对于纯溶剂的吸光度，显色溶液和空白溶液吸光度之差值呈现最大而平坦的区域，即为该显色体系最适宜的pH范围。

⑵、显色剂的用量为了使显色反应进行完全，一般需加人过量的显色剂。

但显色剂不是越多越好。

对于有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。

在实际工作中，通常根据实验来确定显色剂的用量。

⑶、显色反应时间有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变；有些显色反应虽能迅速完成，但有色配合物的颜色很快开始褪色；有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。

因此，必须经实验来确定最合适测定的时间区间。

实验方法为配制制作吸光度-时间曲线，根据曲线来确定适宜时间。

⑷、显色反应温度通常，显色反应大多在室温下进行。

但是，有些显色反应必需加热至一定温度才能完成。

⑸、溶剂六、光度测量误差及测量条件的选择1.光度测量误差⑴、偏离朗伯—比耳定律所引起的误差在实际工作中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光这种情况称为偏离朗伯-比耳定律。

若在曲线弯曲部分进行定量分析，将会引起较大的误差。

偏离朗伯-比耳定律的原因主要是仪器或溶液的实际条件与朗伯-比耳定律所要求的理想条件不一致。

引起这种偏离的因素很多，大致可分为两类：一类是物理性的，即仪器性的因素；另一类是化学性因素。

①物理性因素物理性因素引起的偏离中最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。

②化学性因素可能引起对朗伯-比耳定律的偏离。

⑵、仪器测量误差仪器测量误差可能来源于光源不稳定、实验条件的偶然变动、读数不准确及仪器噪音等。

其中透光度与吸光度的读数误差是衡量测定结果的主要因素。

也是衡量仪器精度的主要指标之一。

在实际测定时，只有使待测溶液的透光度T在15%～65％之间，或使吸光度A在0．2～0．8之间，才能保证浓度测量的相对误差较小(∣Er∣<4％)。

当透光度T=36.8％或A=0.434时，浓度测量的相对误差最小。

2、测量条件的选择⑴、选择适当的入射光波长根据吸收曲线，以选择被测组分具有最大吸收时的波长(λmax)的光作为入射光，这称为“最大吸收原则”。

选用λmax不仅灵敏度高，而且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯一比耳定律的偏离。