葡萄的组织培养技术湖北第二师范学院1.葡萄外植体的采集和消毒1.1外植体是从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。

在该组织培养中，用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。

葡萄脱毒过程中，外植体的大小与脱毒率高低成相关性。

所以选取外植体的大小适宜在葡萄脱毒过程中应要掌握好.葡萄在茎尖培养中，光的效果通常要比暗培养好。

一般多采用光培养的方式，试管苗培养适宜的温度是25+/-2度1.2防止外植体带菌1.2.1选择好外植体采集时期和采集部位1.2.1.1外植体采集以春秋为宜；1.2.1.2优先选择地上部分作为外植体；1.2.1.3阴雨天勿采，晴天下午采集；1.2.1.4采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。

1.2.2室内或无菌条件下进行预培养。

1.2.3外植体严格灭菌灭菌效果实验多次灭菌和交替灭菌1.3培养材料的消毒1.3.1先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。

1.3.2在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。

1.3.3再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水消毒10分钟。

1.3.4取出后用无菌水冲洗三、四次。

1.4制备外植体将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。

“然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。

2.培养基的成分及制备2.1培养基的成分组织培养过程中，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的。

因此，培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。

所有这些物质，可概括为5大类：2.1.1无机营养物培养基的各种盐类中均含有氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、硼、锰、铜、锌、钼、氯。

无机氮可以两种形式供应，即硝态氮和铵态氮。

有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。

铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，目前皆用螯合铁，即硫酸亚铁加乙二胺四乙酸钠配成。

2.1.2有机物质主要有两类：一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢等必要元素，如糖类、氨基酸及其酰胺类；另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用，如硫胺素、吡哆醇、烟酸、生物素、肌醇、单核甘酸及其碱基。

2.1.3植物生长刺激物质激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态，质地和分散性。

以ＭＳ为基本培养基，附加适量的细胞分裂素6-BA和NAA。

最适的培养基配方为MS+6-BA0.5-3.0mg/L和NAA0.01-1.00mg/L，且培养基中添加蔗糖有增加丛生芽数量的作用。

2.1.4其他附加物这些物质不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益。

琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，本身并不提供任何营养.琼脂条的用量在6—10g／L之间，抗生物质，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5—20mg/L之间。

添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其对大量通气长期培养，效果更好。

对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。

应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。

3.1.5其他对生长有益的未知复合成分常用的为植物的天然汁液，如酵母提取物等。

他们的作用是供给一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质等.以下为MS培养基配方:下面列出继代培养和试管苗培养的培养基配方。

①继代培养和生芽培养的培养基配方是：MS培养基+6BA(质量浓度为0.5～1.0 mg/L) +NAA(质量浓度为0.1～0.15 mg/L)。

即在1 L MS培养基中加入5～10 mL6BA和1～1.5 mL的NAA母液。

NAA配合6BA，可以促进不定芽的生长。

②生根培养的培养基配方是：MS培养基+NAA(质量浓度为0.1～0.5 mg/L)。

即在1 L MS培养基中加入1～5 mL的NAA母液。

NAA起促进生根的作用。

2.2培养基制备的方法2.2.1培养基配方的选定使用标准方法，应严格按其规定进行配制.2.2.2培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

2.2.3培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。

完全称取完毕后，还应进行一次检查。

2.2.4培养基各成份的混合和溶化配置母液时，各种化合物一定要单独充分溶解后再倒入容量瓶中定容，避免其中的离子之间发生沉淀.激素一般难溶于水，所以生长素用少量0.1mol/L NaOH溶液，少量0.1mol/L HCL溶解，然后用蒸馏水或去离子水定容。

最好使用不锈钢锅加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。

在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化。

待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。

如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。

在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。

2.2.5培养基pH的初步调正因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。

对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证培养基的质量。

PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。

2.2.6培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。

一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。

2.2.7培养基的分装培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。

分装量不得超过容器装盛量的2/3。

容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎。

分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。

分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。

每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。

2.2.8培养基的灭菌可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。

某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。

抗生素则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。

琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。

2.2.9培养基的质量测试每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍,并测定其最终pH。

将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。

用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24~48小时，如无菌生长或生长不好。

应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。

2.2.10培养基的保存培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。

放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。

每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。

3.接种过程3.1准备工作在正式接种之前要做好准备工作，包括准备酒精灯、灭菌用脱脂棉以及准备接种工具、分取培养基、接种用苗和工作台灭菌等。

3.2接种过程操作人进入接种室，酒精棉球擦拭手掌；外植体移入工作台面，用升汞（0.9%）浸泡，再用酒精快速擦拭；无菌水漂洗数次。

点燃酒精灯，用具入酒精瓶浸泡数分钟，取出在酒精灯上灼烧。

拿出培养皿；外植体放在培养皿中，用刀子切割，镊子接种于培养瓶中每瓶接种4－10个。

封口膜要及时捆绑，其松紧度以用手转不动为准；下台前要把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。

3.3在适宜的培养条件下进行培养.4.培养条件4.1.温度：，培养温度为25Ċ，3-4周更换一次培养基。

3次重复。

4.2.光：刚开始无光,一段时间后保持光照10-12h/d，光强800-1200LX。

4.3.渗透压：渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。

在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。

4.4.PH:保证培养基pH为5～6．5。

在培养过程中pH可发生变化，磷酸氢盐或二氢盐起到缓冲作用，可起稳定作用。

4.5通气：悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。

小量悬浮培养时时常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。

5.愈伤组织的形成和试管苗的培养5.1愈伤组织的培养一般来说，从接种外植体到出现愈伤组织，需要经过2周时间。

2周之内就可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。

首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭，不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长得更快。

2周以后，由于培养基中的营养成分已接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。

5.2愈伤组织的继代培养：进行继代培养所用的培养基，和培养愈伤组织所用的培养基相同。

在严格的无菌条件下(接种箱内)将愈伤组织连同原来的外植体，一起移到新的培养基上。

愈伤组织的继代培养，一代为20 d。

如果延长培养时间，培养基中的营养物质会减少，外植体也会分泌一些有毒物质，造成自身中毒。

20 d以后，可以根据愈伤组织的大小，决定是继续进行继代培养，还是进行试管苗培养。

如果愈伤组织长到直径为1～1 5 cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需要进行第二次继代培养。

在愈伤组织进行继代培养期间，可以将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光。

愈伤组织见光后，颜色可以转为绿色。

试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的培养。

试管苗的培养分为生芽培养和生根培养。

要想培育出一株完整的试管幼苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养。

如果顺序颠倒，先诱导生根，就不好诱导生芽了。

生芽大约需要4～6周的时间，而生根培养时，1周以后就可以见到幼根了。

注意，试管苗应该进行见光培养。