实验三酱油双菌种制曲
1.实验目的
在掌握基础微生物学知识的基础上，运用发酵调味品工艺学中讲述的理论知识，并结合微生物菌种活化、扩大培养、摇瓶液体培养的技能，分离原料利用率高、适用性强的主要霉菌并进行双菌种制曲,缩短酱油制曲周期、改善产品品质。

掌握酱油生产过程中制曲环节的微生物、主要步骤、操作条件等。

2.原理
酱油酱醅中栖息着种类繁多、数量丰富的微生物,主要为米曲霉和黑曲霉。

米曲霉分解蛋白质能力强,黑曲霉糖化能力强。

由于现实状况是蛋白质原料不足,且不是纯蛋白;淀粉质原料多,且不是纯淀粉,因此应相应地补充蛋白酶和淀粉酶来提高蛋白质原料利用率和氨基酸生成率。

曲霉类微生物是酱油制曲过程中的主要微生物。

其中，米曲霉分解蛋白质能力强,黑曲霉糖化能力强。

进行双菌种制曲可以结合两者之优点，缩短酱油制曲周期、改善产品品质。

3.试剂和仪器设备
3.1菌种：酱油酿造用黑曲霉、米曲霉。

3.2试剂：碘化钾、氢氧化钠、乙酸、硫代硫酸钠、酚酞、甲醛等为分析纯,麸皮、为食品级。

3.3设备仪器：酒精灯、显微镜、接种环、培养箱、洁净工作台、电热恒温鼓风干燥箱,恒温生化培养箱、自动立式高压蒸汽灭菌锅等。

4.实验步骤
4.1 种曲的制造
麸皮∶水1∶1,倒入250 mL的三角瓶,塞好棉花塞,摇动三角瓶,使料水充分混合均匀,厚度以1. 5 cm左右为准。

0. 1 MPa灭菌30 min,灭菌后趁热摇松曲料。

每个三角瓶在无菌条件下接入三环试管斜面菌种,逐个摇动使之混合均匀。

30℃恒温培养,18 h左右再摇瓶使结块散开,继续置于30℃恒温培养4 h至物料结饼明显时进行倒置培养1 d,使上下菌丝生长一致。

当孢子初显黑色或褐色时停止培养,然后置于阴凉处备用。

麸皮、水→混合→蒸料→摊冷→接种→装盘→第一次翻曲→第二次翻曲→种曲。

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扩大培养纯种
4.2设计不同条件进行实验，分别测蛋白酶活力（报告中按照实际设计的方案书写）
（1）制曲温度
（2）制曲时间
（3）曲料水分
（4）接种比例（将第六组的数据列入这一系列）
（5）接种量
（6）蛋白酶活力测定方法
称取研细均匀的成曲样品10 g,放入200 mL锥形瓶中,加55℃温水80 mL,充分摇匀,置55℃恒温水浴锅中保温3 h,取出后加热煮沸,以破坏酶活力,冷却后定容至100 mL,充分摇匀后以脱脂棉过滤,吸取滤液10 mL,移至150 mL锥形瓶中,加水50 mL,1%酚酞指示剂0.2 mL,以0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH 8.2),记下滴定数作为总酸。

继续加甲醛10 mL,用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至深红色(pH为8.5)为终点,记下滴定数。

另称取成曲10 g做水分测定,再折算成干基数。

蛋白酶活力=(V1-V2)×C×0.014×100/(1-W)。

式中:V1为加入甲醛后氢氧化钠标准溶液滴定
数(mL);V2为甲醛空白滴定数(mL);W为成曲水
分(%);C为氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L);
0.014与1 mol的氢氧化钠相当的氮的量。

4.3根据所测各酶活力的大小，确定出较优培养条件，完成制曲过程。

5.实验数据及其处理
测定不同培养条件下的蛋白酶活力，绘制数据曲线图。

6问题讨论
酱油酿造过程中的微生物有哪些？各起什么作用？。