粪便温孵法 肠菌酶法
单一菌种温孵法
肝微粒体的制备
差速离心法
通过高速离心 使微粒体与其他成 分分离，操作简单， 无需其他试剂辅助， 但需要的时间长， 对设备的整体要求 高。
CaCl2沉淀法 制备肝微粒体， 即在离心前额外加入 CaCl2 ， 促 进 微 粒 体 的聚集和沉降。这种 方法对设备要求降低， 而且缩短了实验所需 的时间，是研究药物 体外代谢，制备微粒 体的常用方法。
要从尾部下四分之一处进针,血管表浅,好扎,而且如果 万一没打进,还可以向上找位置再打
进针后, 有没有回血很重要,回血肯定扎进了,如果没 有自动回血的话,轻轻回抽下,有回血的话就注射,扎进 血管,注射通畅,没有阻力。如果很难推进，一般是没 扎进，就不要再推了，打到组织里面会水肿，然后整 个血管就看不清了，无法注射。自己觉得没回血最好 别注射，换位置，一般是没进。 注射完毕一定要止血，不然药物可能随血流出来，给 药量不准了。
胆管插管
将麻醉大鼠仰位固定于手术板
沿腹白线用粗剪刀剖开腹腔2-3cm
沿十二指肠降部肠系膜找到白色透 明具有韧性的胆总管
在接近十二指肠开口处，向肝脏方 向剪“V”形口
将胆汁引流管插入胆总管，引出腹 壁，结扎固定
胆管插管
胆管插管注意事项： 腹腔解剖的开口越小越好 分离胆管和插管的过程中，注意不要弄破管周围 的小血管，避免刺激胰腺组织，以免影响胰腺分 泌 收集胆汁过程中注意给大鼠保存体温,操作板放在 水浴锅上，给大鼠盖上纱布。
动物的排泄物对动物的生长影响很大，所以每2-3天要 换垫料，具体视情况而定。一定要换新笼具，换垫料。 不可偷懒将旧的垫料倒掉，不洗盒子直接加新垫料，或 者直接在盒子里再铺一层新垫料。这样不仅影响自己的 实验，而且同在一起饲养的动物也会受到影响。 每天要给动物换水，同时清理饮水瓶,金属嘴和胶塞， 时间久了不换，瓶内和胶塞可能会被微生物污染而长苔。 水不要装太满，太满了可能滴不出来，动物喝不到。更 规范的操作还要对饮水用具和实验工具进行高温灭菌。
2013年4月seminar
药物代谢研究中的实验方法， 基础操作及注意事项
汇报人: 汇报日期:
** 2013-4-12
药物代谢的基本概况
动物实验的基本操作及注意事项
生物样品的前处理
广义的药物代谢 A D M E
吸收 Absorption
分布
Distribution
代谢 Metabolism
排泄
Excretion
小鼠摘眼球取血(眶动脉和眶静脉取血)
剪胡子,防止溶血
抓取小鼠后,按住头部,压迫眼球使其充血突出,小鼠眼球尽 量鼓出,用镊子尽量多的夹住眼球往外拉,不然可能没有破 坏血管,不出血 用眼科弯镊迅速取出眼球,血滴入离心管中一定要快,一下 取出眼球，一下没取出眼球,动作慢可能就凝血了,血就取 不出来了,虽然很残忍,但是犹豫还是没取出血,而且动物还 是死了
时间很长，而且动物送过来还用适应性喂养3-7天。订动
物时候要说清楚动物的种类，级别，雌雄，体重，日龄， 数量，以及签收人,避免出现送错，或者反复询问，很麻 烦。签收的时候要发票和合格证。
动物的适应性喂养 动物从一个地方到一个新环境，而且在运输过程中，动物 的自身节律受到影响，需要恢复。在适应性喂养过程中， 观察动物是否健康，包括进食，饮水，毛发，排泄物，活
一定要心静,快准稳,不要犹豫,多多练习,手感很重要。
大鼠眼眶取血(眼眶后静脉丛取血)
取血的毛细管制作：先将毛细管浸泡在1％肝素溶液中数分钟，取出
干燥备用。注意割毛细管的时候,断面一定要平,不然大鼠很疼,就特 别挣扎,而且不好扎进去 取血前要给大鼠剪胡子,不然容易溶血 大鼠保持侧卧位左手拇指、食指抓住两鼠耳之间的颈部头皮，并轻 轻向下压迫颈部两侧，致大鼠静脉血回流障碍，眼球外突，眶后静 脉丛充血右手持毛细管由大鼠的目内眦部插入结膜，使毛细管与眶 壁平行地向喉头方向推进，深度约3—5mm，轻轻旋动毛细管，使其 穿破静脉丛，让血流顺毛细管流出,用离心管接血
这些都是非常细小问题，不过还是挺重要的。
给药途径
灌胃时注意事项:
体位为头高尾低
针插入时应无阻力 。若 感到阻力或动物挣扎时， 应立即停止进针或将针 拔出，以免损伤食道以 及误入气管,导致小鼠死 亡
腹腔注射
注意事项：
体位腹部向上,头低位 右侧下腹部,沿皮下进针 3-5mm,然后针倾斜约45 度刺入腹腔注意，要变 换下角度，不要一直往 前刺，要刺伤内脏
尾静脉注射
尾静脉注射
老鼠尾部有三根血管,左右两边的表浅,容易注射,中间的 很难打,一般不要选择中间,如果左右两边都打废掉了,迫 不得已可以试试。 注射前用酒精反复擦拭尾部血管,一是消毒,主要是使血管 充血,如果天冷,或者血管不明显的时候,可以用热水,但是 要注意温度,不能太烫了，这样一般都可以看清。 针的选择最好用头皮针,更细,好打,但是头皮针的软管会 占一定体积的药物,如果配的药没那么多的话,用1ml的注 射器针头也是可以的。 进针的时候角度要小，尽量平着进针，进针后上挑,不然 血管可能直接扎穿了。
• 体外孵育是很好的累积代谢产物的方法。在代谢 产物的分离和结构鉴定方面有应用价值。可以直 接用肝匀浆液和肠内容体外孵育来制备代谢产物。 在实验过程中要冰浴，快速，尽量确保酶的活性。
动物实验的基本操作
订实验动物 一般计划要做药理实验后，先订动物，饲养中心送动物 过来需要时间，如果动物供应紧张的时候，很可能等的
另外在动物房不可大声说话，之前动物房养豚鼠的时候，大 家都很小心，其实大小鼠对噪声也是敏感的。 进出动物房，一定要关门，这个很重要，如果有野鼠进来就 麻烦了，不光饲料会被吃的问题，对动物的影响很大，听说 之前有发生过，大家很长时间没养动物，用耗子药灭鼠。 关于处死以后动物尸体的处理，以前都是直接扔了，从去年 年末开始，实验楼这边对实验后的动物尸体有了统一管理， 需要自己讲动物尸体送到实验楼B楼或F楼，有专门人负责 收。
动等情况，将有异常的动物隔离，实验时最好不用，另外
观察。不要不观察喂养就急匆匆的做实验，可能在取空白 组织的时候发现组织病变或者时候几天后空白组竟然出现
了死亡。所以适应性喂养还是很重要的。
饲养中心送来的动物到了以后，自己要将动 物放置在笼具里喂养。小鼠笼每笼10只左右， 不超过12只，大鼠笼每笼5只左右，不超过7 只。雌雄分开。大鼠不可用小鼠笼，力气大 的可能会跑出来，如果人不在，动物跑出来 了，那就麻烦了。
固相萃取法（ＳＰＥ） ＳＰＥ又称液—固萃取技术，其原理是将不同填料作 为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品通过小柱 时，由于受到吸附、分配、离子交换或其他亲和力作用， 药物或干扰物质被保留在固定相上，用适当溶剂洗除干扰 物质，再用适当溶剂洗脱药物。
生物样品的前处理 生物样品：
血液、尿液、组织匀浆、胃液、胰液、胆汁、粪便、体外 代谢的孵育液等样品。
特点：
①采样量少；②待测物浓度低；③干扰物质多；
体内样品预处理的目的：
⑴使待测药物游离，以便测定药物或代谢物的总浓度； ⑵满足测量方法的要求，纯化浓缩样品； ⑶保护仪器性能、改善分析环境
去除蛋白质
肝微粒体 孵育体系：药物+缓冲盐+含不同供体的辅因子体系
肝微粒体体外Ⅰ相 启动反应 NADPH 代谢溫孵法 肝微粒体体外葡萄 启动反应 糖醛酸结合代谢溫 UDPGA 孵法 肝微粒体体外硫酸启动反应 PAPS 结合代谢溫孵法
• 肝微粒体酶制备100000转的超高速离心机，目前 实验室还没有条件。有直接买肝微粒体来做体外 代谢实验的，但是体外实验酶活性很难控制，酶 容易失活。一般在体外实验中要设立阳性对照组， 来反应酶的活力。
药物代谢-生物转化
一相代谢
氧化，还原，水解反应； CYP450酶
二相代谢
内源性物质结合反应； UGTs，SULTs, NAT, GST, MT
药物代谢研究方法
体内代谢法 综合地考虑各种体内 因素对药物的影响,能 够真实全面地反映药 物代谢的体内整体特 征 药物在生物体内的分 布比较广，加上代谢 转化的器官和酶系的 多样性，使药物及其 代谢产物在体内的浓 度低，代谢产物的检 测具有一定的难度
原则上动物实验不可在动物饲养室做，但是我们实验 室基本上只能在动物房实验。所以要注意下面几点： 实验操作台面最好离饲养（不进行实验的）的动物 远一点，减少对动物的影响。 实验前清理干净台面在进行，实验后在清理干净，实验完后，将里面的乙醚和棉花及时 处理掉，不然整个动物房都是乙醚的味道，对动物 影响很大，更要及时的换气。
体外代谢法 方便控制代谢条件,代谢 系统单一,易于对代谢物 进行分离、提取,尽快确 定药物代谢途径及结构 变化情况, 在代谢产物的结构确定 方面具有突出的优越性 但不能全面反映体内的 综合代谢情况,与生物体 内的真实代谢情况存在 一定差异
体外代谢主要方法
体外肝脏 代谢
体外肠菌 代谢
有肝微粒体温孵法 肝细胞体外温孵法 肝脏灌流技术 肝组织切片法 基因重组酶系 微透析技术
血流的过程中可以按摩小鼠心脏，取血量会多一点 不过此方法的确很残忍,有些国家动物福利法不允许,所 以后实验设计或者有欲投的杂志,还要注意下这方面的信息
大鼠腹主动脉取血
真空管和采血针，用真空 将腹主动脉的血吸出来 穿刺时候,将固定大鼠的 操作板倾斜,这样便于穿 刺,还可用镊子将大鼠腹 部垫高,方便穿刺。 将腹主动脉周围的脂肪组 织，筋膜钝性分离干净, 暴露出腹主动脉。 色淡的为腹主动脉，与下 腔静脉（暗红）伴行，穿 刺后不要乱动，以防针出 来，真空漏掉和喷血。
大小鼠的解剖，用文字很难讲明白，可以以后实验的时候看 具体的操作。 讲一下做组织分布时组织匀浆的注意事项： 取出心肝脾肺肾脑等器官在冰过的生理盐水中洗干净浮血， 用滤纸吸干，放在锡箔纸中。注意要挤干净心脏中的血液， 但是所有组织不得到生理盐水中浸泡过长时间，可能影响 到药物的浓度。 称组织的时候，注意对称平行，重量和取的部位要一致， 比如都取肝左叶等。 匀浆过程中要注意都在冰上操作，所有过程尽量快。 匀浆前要把组织剪的尽量碎（冰上操作，快），不然匀浆 的时候组织纤维会堵在匀浆的转头上面。 每次匀浆前，匀浆的工具都要洗净，并用生理盐水浸润。