米左右，使温度维持在-80℃至-100℃。将平衡后的精液 用滴管按一定量（每毫升稀释精液，滴冻10±1粒，滴管 应事先预冷 ）滴于铜纱网、滴完最后一滴，熏蒸３—５ 分钟后，当精液颗粒颜色变白时，立即浸入液氮，并将全 部颗粒取下，收集于贮精瓶或纱网布袋内，并做好标记， 然后立即移入液氮罐中贮存。
细管冻精方法
2、卵子或胚胎冷冻保存
小分子渗透冷冻保护剂+大分子非渗透性冷冻保护剂 程序冷冻
玻璃化冷冻
1、冷冻胚胎的选择： 用于冷冻保存的胚胎必须是形态良好的、发育正
常
的高质量胚胎，可以通过超数排卵及人工授精和体外 受 精获得。
2、程序冷冻：
1、10%甘油或乙二醇+0.25M Sucrose，程序降温1℃/min，形 成冰晶。 2、程序：抗冻保护剂的添加、程序降温、植冰、解冻、 防冻剂 的去除
胚胎装管：
将平衡好的胚胎移入冷冻液中，然后将胚胎装入冷冻管内。
降温程序：
慢速冷冻：室温
-7℃
1℃/分 植冰 0.3 ℃/分
-30 ℃
液氮
冷冻速度 a. 在胚胎冷冻的早期研究中，大多采用慢速冷冻，以保证胚胎 脱水充分，避免形成冰晶。
b.快速冷冻方法的建立使冷冻程序更为简单、方便。
3、玻璃化冷冻OPS(Open Pulled Straw)法：
精液冷冻步骤：
采精
精液品质检查 精液的稀释 精液保存
（一）、采精：
定义：借助特定的器械将雄性的精液采集出来的技术。
（一）假阴道法 Artificial vagina （牛、羊） （二）手握法和筒握法 A gloved hand （猪） （三）按摩法采精 Massage method （犬、鸡） （四）电刺激采精法 Electroejaculation（野生动物和丧失交配能力
抗冻保护剂的种类：
1、小分子渗透性抗冻保护剂
甘油、乙二醇、丙二醇、DMSO等
2、大分子非渗透性抗冻保护剂
蔗糖、聚蔗糖、棉子糖，麦芽糖，海藻糖等
3、卵黄（sperm）
冷冻保存及解冻方法
一、精液 二、卵子或胚胎
一、精液冷冻：
小分子渗透冷冻保护剂（甘油）+卵黄，液氮蒸气熏 蒸或干冰冷• •
•
颗粒 A．12.0％蔗糖液75.0mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。
B．0.11％乳糖液75mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。 C．2.9％柠檬酸钠液73.0mL，卵黄20.0mL，甘油7.0mL。 D. Tris 3.44 g，柠檬酸1.83 g，果糖1.26 g，卵黄15%，甘油5%。 所有稀释液每100.0mL中添加青、链霉素各10万单位，现配现用。
解冻：将胚胎从液氮中取出，通过一定程序恢复到室温。 冷冻保护液为含有非渗透性冷冻保护剂的溶液，以避免渗透压 的迅速变化对胚胎造成的损伤。解冻后的胚胎需在此液中停留一段 时间以除去渗透性冷冻保护剂。
6、解冻和去保护剂过程
慢速解冻：20℃/分 快速解冻：360-500℃/分，30-37℃水浴 解冻时，将装有胚胎的冷冻管从液氮罐中取出，在室温下 停留10秒，然后放入30℃水浴40秒，用消毒的干纱布擦净管， 剪断细管两头，将胚胎和冷冻保护剂倒入解冻液中，6-7分钟后 移入培养液，洗涤3次后培养。（程序冷冻的解冻方法） 从液氮中取出已冻存的OPS管，手指堵住OPS管尾，管 尖端插入解冻液中，胚胎和冷冻液被转移到解冻液1中，停留 5min后转入解冻液2，再停留5min，最后移入培养液，洗涤3 次后培养。（OPS的解冻方法）
四、配子与胚胎冷冻保存 五、胚胎移植 六、性别控制
胚胎移植
• 手术法胚胎移植（小鼠、羊） • 非手术法的胚胎移植（牛）
家畜胚胎移植操作步骤
供、受体的选择
供体的超数排卵与人工授精
受体的同期发情
胚胎的收集
胚胎的检查和评定
胚胎的移植
牛 胚 胎 移 植 示 意 图
牛 非 手 术 胚 胎 移 植 示 意 图
第五部分 胚胎生物技术
四、配子与胚胎冷冻保存
五、胚胎移植
六、性别控制
配子与胚胎冷冻保存
概念：配子与胚胎冷冻是指采用抗冻保护剂 对配子或胚胎进行脱水处理，再经过降温程序使 胚胎最终在-196℃条件下停止代谢活动，条件适 宜时解冻并使其恢复活力的技术。
意义：建立配子库、胚胎库；保护生物多样 性和珍惜濒危动物遗传资源；遗传资源及动物模 型的国际范围内运输；避免运输过程中携带细菌 或病毒。
双头和双尾精子
8、精子顶体异常率
顶体与精子受精能力直接有关，牛超过14%，猪超过 4.3%，显著降低受精率。
(三)、精液稀释液
•
细管 A．一液：2.9％柠檬酸钠液100.0mL，卵黄10.0mL。
二液：取一液41.75mL加果糖2.5g，甘油7.0mL。 B．脱脂牛奶83.0mL，卵黄10.0mL，甘油7.0mL。
• 所需器械：移植枪
非手术法胚胎移植操作步骤（牛）
1 、受体牛在发情后6—8天之间均可进行移植（发情之时定为0 小时）。移植前对受体牛进行直肠触摸，检查黄体是否合格。合格 者用于移植。 2、 在移植之前必须先进行尾椎硬膜外麻醉 ，擦拭外阴部。 3、 对照供体牛采胚记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配 受体和胚胎。 4、 解冻胚胎。 5、 重新将胚胎装入0.25ml塑料细管（直接解冻移植法不需要重 新装管）。 6、 细管装入移植枪。 7、 把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软 外套。 8、 将胚胎移植到受体黄体侧的子宫角大弯处。 9、 做好受体移植记录。
所需仪器：细管灌封一体机（NFA-S1，富士平工业株
式会社）
简易方法：用1ml注射器（把200μL取样枪头从中间剪开，
将尖头部插入注射器头部）将精液吸入0.25 mL的细管内， 管尾部留约1cm的空间，以备封口用，然后用PVC粉末封 口，记号标识。
冷冻程序：将装好精液的细管装入金属架式网盒中，放
入冷冻,在距离液氮上方5cm熏蒸15min后浸入液氮里保存.
防冻剂去除过程也有多步法和一步法。 常规冷冻法：PBS+20%FCS+0.25M蔗糖。 OPS法：a. TCM199+20%FCS+0.3M蔗糖（5分钟） b. TCM199+20%FCS+0.15M蔗糖（5分钟） 或直接进入TCM199+20%FCS+0.25蔗糖中进行移植。
第五部分 胚胎生物技术
• 稀释后的精液，采用逐渐降温法。在1～1.5小
时内，使稀释精液的温度降到4～5℃；然后再在
同温的恒温容器内平衡2～4小时。
（四）、精液冷冻保存方法：
1、颗粒精液 2、细管精液
颗粒冻精方法
• 所需器械：采用聚四氟乙烯板（简称氟板）、铜纱网、
尼龙网或铝板均可。
• 程序：在装有液氮的容器上置一铜纱网，距液氮面２厘
•
精液稀释方法
• 1、一次稀释法：
将采出的精液用含有甘油的同温稀释液按比 例一次加入（常用于颗粒精液）。
• 2、二次稀释法：
将采出的精液用不含有甘油的常温稀释液一 按精液品质稀释，放入4 ℃平衡，然后加入等温 的含甘油的第二液，加入量等于第一次稀释的精 液量（常用于细管精液）。
降温和平衡（预冷）
1）、35%-40%的抗冻保护剂（乙二醇、DMSO），迅 速投入液氮，降温速率3000℃/min，形成玻璃化状态， 不形成冰晶 。
2）、程序：抗冻保护剂的添加、快速降温、解冻、防
冻剂的去除
OPS法冷冻程序：
VS1: TCM199+20%FCS+10%EG+10%DMSO (1分钟) VS2: TCM199+20%FCS+20%EG+20%DMSO （25秒） 39℃条件下完成。
精液质量控制（国标）
• • • • • • • • • • • • •
1、剂量： a. 细管：中型0.5毫升；微型0.25毫升。 b. 颗粒：0.1±0.01毫升。 2、精子活力 解冻后活力，指呈直线前进运动的精子百分率（下限）30％（即0.3）；精 子复苏率（下限）50％。 3、 每一剂量解冻后呈直线前进运动的精子数 细管：每支（下限）1000万个。 颗粒：每粒（下限）1200万个。 4、 解冻后的精子畸形率（上限）20％。 5、 解冻后的精子顶体完整率（下限）40％。 6、 解冻后的精液无病原性微生物，每毫升中细菌菌落数（上限）1000个。 7、 解冻后的精子存活时间 在5～8℃贮存时（下限）为12小时；在37℃贮存时（下限）4小时。 牛冷冻精液必须符合上述各项指标。否则，不得使用。
抗冻保护剂：
通常在冷冻液中添加抗冻保护剂形成高渗，细胞内 水分外流的同时，抗冻保护剂内流至配子或胚胎细胞内， 抗冻剂存在使溶液的冰点降低，使胚胎有更多的时间把细 胞内的水分脱出，避免形成冰晶。但抗冻剂具有毒性，尤 其在高浓度和高温情况下毒性更大。
冰晶与抗冻保护剂毒性/渗透压打击之间的平衡：
冷冻过程中除了冰晶、抗冻剂毒性外，还要考虑渗 透压打击。因此冷冻成功与否就在于在冰晶和抗冻剂毒性 和渗透压打击之间的平衡点。抗冻保护剂浓度越高、处理 时间越长脱水越彻底，但毒性和渗透压打击越大。
冷冻保护剂的添加（程序化冷冻)： 可采用多步法或一步法。胚胎移入冷冻保护液需平衡 一段时间，以保证保护剂完全渗入细胞内。平衡时间的长 短视胚胎和冷冻保护剂渗透情况而定。冷冻前胚胎长期接 触保护剂会产生毒害作用，一般平衡时间10-30分钟。 （牛冷冻液：PBS+20%FCS+10%甘油（乙二醇）+0.25M蔗糖）
但种用价值高的公畜）
（二）精液品质鉴定：
1、外观：
颜色： 一般为乳白色或灰白色。正常牛羊精液呈乳白色或乳黄色，猪、马的 精液呈淡乳白色或浅灰白色。
正常精液特征
依从浓到稀：乳黄-乳白-白色-灰白