染色质免疫共沉淀(ChIP)
目录
一、简介
电泳迁移率变动分析
生物信息学方法
DNA与
ChIP 蛋白质 相互作 用研究
酵母单杂交系统
DNase Ⅰ足纹法
一、简介
ChIP 是目前唯一研 究体内DNA与 蛋白质相互作 用的方法。不 仅可以检测体 内反式因子与 DNA的动态作 用，还可以用 来研究组蛋白 的各种共价修 饰与基因表达 关系。
取上清
200μlChIP洗脱 溶液洗脱
Beads 取上清
200μl,ChIP洗脱溶液(3 次)
600μl洗脱液
6、去除甲醛交联
①加5mlNaCl使用NaCl终浓度为 0.2mol/l
②阴性对照+350μlChIP洗脱溶液 +16μl 5mol/l NaCl。
③65℃,过夜,去交联。
7、DNA纯化
①酚/氯仿抽提
实验样本
②硅胶柱(60纯0μl化)
50μl阴性 对照
10μlRNase
√
√
50μl蛋白酶K
√
√
等量酚/氯仿/
异戊醇 （25:24:1）
√
√
1/10体积 3mol/l乙酸钠
2倍体积冰冻 无水乙醇
上清液 √
√
上清液 √
√
12000rmp 离心5min
-80℃冰 箱 1h.1200 0rmp离 心20min， 弃上清
二、原理
在活细胞状态下固定 蛋白质—DNA复合物， 并将其随机切断为一 定长度范围内的染色 质小片段，然后通过 免疫学方法沉淀此复 合物，特异性地富集 目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片 段的纯化与检测，从 而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。
三、技术流程
具 体 操 作 流 程
DNA分析
Байду номын сангаас
四、应用
组蛋白修饰研究 转录调控分析 药物开发研究 有丝分裂研究 DNA损伤与凋亡分析
五、优缺点
优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用 的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合 蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因 表达调控的真实情况。
缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得； 为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞 内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的 基因获取可能需要限制在组织来源。
2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。 不同样本都进行超声条件优化实验。
3.14000rpm离心10min（4℃），转移上清于 1.5ml离心管。
3.免疫沉淀蛋白和DNA复合物
ChIP稀释液稀 释10倍
加入20μl蛋白 A/G琼脂糖珠
？ 超声染色质液体 ？ 2ml超声稀释液
4℃摇床摇动一小时
取50μl上清 液作为对照
1000rmp离心2min（4℃） 转移上清液至新离心管
1-4μl免疫沉淀 抗体
4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）
样品 摇动1-2h，4℃
40μlProtein A/G Agarose
Beads
1×PBS洗3次离心 1000rpm,1min.弃上清，
用4μl 1×PBS悬浮
1、甲醛交联细胞
弃上清
具
10 ml1×PBS
4000rpm
体 1ml1.25mol/L 步 甘氨酸
室温10-20min
预冷1×PBS 洗涤两次
弃上清
4000rpm
离心5min
1ml预冷 1×PBS 悬浮
骤
4-5ml预冷1 × PBS
转移
离心5min
新离心管
2、染色质超声断裂
1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min. 每1min颠倒摇动一次离心管。
加入70% 乙醇，悬 浮沉淀， 12000rpm
离心 10min， 去上清， DNA干燥
后， 40μlTE
溶解
8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA 上结合位点的鉴定
(1)如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列 是目的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定 量PCR方法。
(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋 白基因组分布情况，找出转录因子结合位点， 则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIPseq方法。
谢谢观看！ 2020
1000rpm,离心5min,4℃
弃上清
a 低盐洗脱溶液1ml洗一次 b 高盐洗脱溶液1ml洗一次 c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次 d TE溶液(pH8.0)1ml洗两次
每次洗时，在摇床 上摇10min,4℃， 4000rpm离心5min
5、洗脱免疫复合物
Beads 摇床上摇动10min 12000rpm离心1min