2 结果与分析
2.1 抗坏血酸和 DPPH 混合溶液的 UV-Vis 吸收光谱
A
0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00
150
282nm 300
A
450 600 750 波长 /nm
A
3.5
3.0
B
2.5
2.0
325nm
1.5
517nm
1.0
1
0.5
2
3
0.0
150 300 450 600 750 900
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食品科学
※基础研究
抗坏血酸清除 DPPH 自由基的作用机理
李铉军，崔胜云 *
(延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部Байду номын сангаас点实验室，吉林 延吉
133002)
摘 要：采用光谱、电化学和质谱分析方法研究抗坏血酸对 DPPH 自由基清除机理，发现 DPPH 在溶液中是以自 由基形态和含氮 - 氮双键的高度共轭结构的正离子态(DPPH+)存在且抗坏血酸对上述两种形态都有清除作用。由于 DPPH 自由基与 DPPH+ 在溶液中处于平衡态，故同种抗氧化剂用 517nm 波长处 DPPH+ 的吸收强度变化可间接评价 对 DPPH 自由基的清除作用，但对不同抗氧化剂而言，因抗氧化剂对 DPPH 的不同形态相对清除作用的不同会带来 较大的误差或误判。本研究对准确评价抗氧化剂的自由基清除作用具有一定指导意义。 关键词：抗坏血酸；D P P H 自由基；清除机理；分光光度法；循环伏安法；质谱法
O2N · NN
O2N
O2N
+e－, +H + NO2
H NN
NO2
Antioxidant
O2N
DPPH 自由基
DPPH2
图 1 抗 氧 化 剂 递 电 子 、 递 质 子 与 DPPH 自 由 基 生 成 DPPH2 的 反应式
Fig.1 Reaction equation in which electron and proton are transferred from antioxidant to DPPH to form DPPH2
图 2 抗 坏 血 酸 和 DPPH 混 合 溶 液 的 UV-Vis 吸 收 光 谱 Fig.2 UV-Vis spectrum of aqueous ascorbic acid solution and its
mixture with DPPH ethanol solution
由图 2 可知，抗坏血酸因其羰基与 C2 和 C3 间的不 饱合键的共轭作用在 282nm 波长处可观察到羰基的较强 的 R 吸收带，而 DPPH 在 200～250nm 波长范围内可观 察到较强的因苯环共轭导致的 k 带、E 带和 B 带相重叠 的末端吸收带，同时在 323nm 波长处出现 DPPH 自由基 单电子的 n →π* 跃迁导致的吸收带和在 517nm 波长处 出现，可能是由于 DPPH 中的 3 个苯环通过氮 - 氮双键 共轭引起的π→π* 跃迁引起的可见区的吸收带。从以 上紫外光谱分析可推知，DPPH 在乙醇溶液中不仅是以 自由基形态存在，还有可能存在 DPPH 自由基与空气中 的氧作用后生成的高度共轭结构的正离子形态 DPPH+ 导 致其在可见光区具有强烈的吸收光谱，其结构见图 3。
DPPH 溶液在 323nm 和 517nm 波长处有两个特征的 吸收峰[16]。迄今，抗氧化剂对 DPPH 自由基清除率是通 过测定加入抗氧化剂前后 DPPH 在 517nm 波长处吸光度
收稿日期：2010-03-05 作者简介：李铉军(1 97 7 —)，男，讲师，硕士，研究方向为食品分析。E-mail ：xj li @y bu. ed u. cn * 通信作者：崔胜云(1957 —)，男，教授，博士，研究方向为生物分析化学。E-mail：sycui820@
本实验以具有递电子和递氢能力的抗坏血酸作为抗 氧化剂，利用分光光度法、循环伏安法(CV)和质谱法比 较研究抗坏血酸清除 DPPH 自由基的反应机理。通过抗 坏血酸和 DPPH 混合溶液的循环伏安分析和质谱测定结 果，提出溶液中不同 DPPH 存在形态和抗坏血酸相互作 用的反应机理。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 1,1 二苯基 -2-苦基肼(DPPH)、抗坏血酸 美国 Sigma
O2N · NN
O2N
－e
NO2 +e
O2N NN
O2N
NO2
DPPH 自由基
DPPH+
图 3 DPPH 自 由 基 和 其 高 共 轭 结 构 氧 化 产 物 的 化 学 结 构 图
Fig.3 Chemical structure of DPPH radical and highly conjugated
公司；氯化钾、无水乙醇为国产分析纯试剂；实验用 水为三次蒸馏水。
UV-8500 紫外 - 可见分光光度计 天美公司；M-273 电化学分析仪 美国EG & G公司；HP 1100-1946A LC-MS 液 - 质联用仪 美国惠普公司。 1.2 方法
新鲜配制 0.1000mmol/L DPPH 无水乙醇溶液及含有 一定浓度的抗坏血酸和 0.1000mmol/L DPPH 的混合溶液。 分别对 DPPH、DPPH 和抗坏血酸混合溶液进行 UV-Vis 吸收光谱、循环伏安和质谱测定。通过比较 DPPH 与抗 坏血酸作用前后的光谱、电化学、质谱测定结果的变 化研究抗坏血酸清除 DPPH 自由基的反应机理。质谱测 定采用无柱色谱端口自动进样，质谱分析条件为：API-ESI 离子源，扫描范围 m/z 100～800，离子源喷射电压 4.0kV，锥孔电压 70V，氮气流速 8.5L/min，毛细管温 度 180℃，检测器为安捷伦 1100 型四极杆质谱检测器。
oxidation product
当 DPPH 溶液中加入 0.02mmol/L 抗坏血酸时，末端 吸收和 323nm 波长处的吸收带及 517nm 波长处的吸收带 的吸收强度都在明显减小(图 2B)，其中波长 517nm 处的 吸光度从 1.07 减小到 0.86，而在 323nm 波长处的吸光
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radical form (DPPH·) and highly conjugated form (DPPH+), and ascorbic acid could scavenge both of them in the solution.
Generally, the two forms of DPPH were at equilibrium in the solution. This makes it possible to indirectly evaluate DPPH
波长 /nm
图 A.抗坏血酸(0.1000mmol/L)溶液紫外光谱图；图 B：1.DPPH (0.1000mmol/L)乙醇溶液紫外光谱图；2. DPPH(0.1000mmol/L)溶 液与 0.0 200mmol/ L 抗坏血酸混合溶液的紫外光谱图；3. DPPH (0.1000 mmol/L)溶液与 0.100mmol/L 抗坏血酸混合溶液的紫外光谱图。
517 nm wavelength. Herein, the radical scavenging mechanisms of ascorbic acid on DPPH radicals were investigated by UV-Vis
spectrometric, electrochemical and mass spectrometric determinations. It was found that DPPH existed in two different forms,
effects on the two forms of DPPH.
Key words：ascorbic acid；DPPH free radical；scavenging mechanism；spectrometry；cyclic voltammetry；mass
spectrometry 中图分类号：O651
DPPH Radical Scavenging Mechanism of Ascorbic Acid
LI Xuan-jun，CUI Sheng-yun* (Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain and Functional Molecules, Ministry of Education,
Yanbian University, Yanji 133002, China)
Abstract ：DPPH radical scavenging properties of antioxidants are generally evaluated by determining absorbance (A517 nm) at
食品科学
※基础研究
度从 1.51 减小到 1.32，说明低浓度的抗坏血酸对 DPPH 自由基和正离子态的 DPPH+ 都具有清除作用。在实验中 也发现，DPPH 溶液加入抗坏血酸后溶液由浅蓝色变为 无色，这是由于抗坏血酸对有色的正离子态的 DPPH+ 具 有分解清除作用所致。当加入的抗坏血酸浓度增加至与 DPPH 浓度(0.1mmol/L)相等时，DPPH 的末端吸收大大降 低的同时 517nm 波长处的吸收带几乎消失，但 323nm 波 长处的吸收带仍有较大的吸收且溶液的颜色从蓝色完全 变为黄色。这一结果说明：当抗坏血酸浓度较高时， 抗坏血酸的还原性导致其直接还原 DPPH+ 的氮 - 氮双键并 使其分解生成具有如下共轭结构的产物(图 4)。