高效液相色谱法前言：高效液相色谱法适用的范围很广，是非常重要的分析方法之一，它在医药学及生命科学中成为一种主要的分离检测手段。

与分离方法的迅速发展的同时，检测技术的不断进步也是高效液相色谱技术得到广泛应用的原因之一。

近年来高效液相色谱检测技术从最常用的紫外可见分光光度检测器和差示折光检测器开始，已经发展了诸如能够实时定性和定量的二极管阵列紫外可见分光光度检测器，能够快速扫描和光谱分辨率更高的色散型紫外可见分光光度检测器以及适用于生物化学的电化学检测器等。

各种联用检测手段如与质谱联用的热喷雾和粒子束接口等已日趋成熟，与傅里叶变换红外光谱和拉曼光谱的联用技术亦在发展中。

各种检测器的灵敏度、线性范围、稳定性和重现性等主要指标日益提高。

许多新的检测手段已为科技工作者所熟悉和使用。

目前比较引人注目和发展较快的为手性化合物的直接检测和通用型质量检测技术。

分离原理在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配，这种分配过程即为色谱过程。

由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离，这就是色谱分析法的实质。

也就是说，当一种不与被分析物质发生化学反应的被称为载气的永久性气体（例如H2、N2、He、 Ar 、CO2等）携带样品中各组分通过装有固定相的色谱柱时，由于试样分子与固定相分子间发生吸附、溶解、结合或离子交换，使试样分子随载气在两相之间反复多次分配，使那些分配系数只有微小差别的组分发生很大的分离效果，从而使不同组分得到完全分离，例如一个试样中含A、B二个组分，已知B组分在固定相中的分配系数大于A，即K B > K A，如图1-1所示。

当样品进入色谱柱时，组分A、B以一条混合谱带出现，由于组分B在固定相中的溶解能力比A大，因此组分A的移动速度大于B，经过多次反复分配后，分配系数较小的组分A首先被带出色谱柱，而分配系数较大的组分B则迟被带出色谱柱，于是样品中各组分达到分离的目的。

设法将流出色谱柱某组分的浓度变化用电压、电流信号记录下来，便可逐一进行定性和定量分析。

一, 高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备,若用于分析则采用脱机或非连续检测。

经典LC填料缺陷,通常是填料粒度大、范围宽、不规则、不易填充均匀、扩散和传质阻力大,谱带展宽加大。

它存在致命弱点:速度慢、效率低和灵敏度低。

HPLC填料(高效固定相)颗粒细,直径范围窄,能承受高压。

达到传质阻力小,分离效率高。

早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备,液膜厚度df大,这和GC一样,会大大降低色谱柱的柱效。

现代HPLC填料大多采用键合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效。

高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题:一是柱流动阻力大大增大,因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大,要采用专业的装柱技术。

高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的。

现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。

不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。

高效液相色谱的原理与经典液相色谱相同,但是它采用了高效色谱柱,高压输液泵和高灵敏度检测器。

因此，高效液相色谱的分离效率,分析速度和灵敏度大大提高。

定量准确,达到可与GC相媲美的分离分析性能。

特别是结合计算机技术,HPLC已成为高度自动化和智能化的现代分析仪器。

经典的液相色谱法,流动相在常压下输送,所用的固定相柱效低,分析周期长,例如柱长170㎝,柱内径0.9㎝,流动相速度30㎝3/h,约需20多小时才能分离出20种氨氨基酸；而用高效液相色谱法,只需1小时之内就完成。

而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论,流动相改为高压输送,色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料(几微米至几十微米)填充而成,均匀规则的固定相、传质阻力小、分离效率高。

柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或100几十万)，同时柱后连有高灵敏度的检测器,使分析灵敏度比经典色谱有较大提高。

例如用紫外检测器最小检测限可达到10-9g，而荧光检测器则可达到10-11g。

虽然气相色谱法是一种很好的分离、分析方法，它具有分析速度快,分离效能好和灵敏度高等优点。

但是气相色谱仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质。

据估计,在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15%,加上制成衍生物的化合物,也不过20%左右。

由于大量有机物,离子型化合物易受热分解或失活物质不能用GC分析,因此需要发展HPLC。

对于高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物,离子型化合物及高聚物等,很难用气相色谱法分析。

为解决这个问题,70年代初发展了高效液相色谱。

二高效液相色谱法与气相色谱法比较HPLC的保留值等色谱分析有关术语以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。

因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率方程H=A+B/u + Cu式中：纵向扩散项(分子扩散项)B/u对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。

气相色谱(GC)的流动相流速u增大时，板高H显著增大(即柱效显著降低)，而液相色谱(LC)的流速增大时。

板高增大不显著(即柱效降低不显著)。

这说明高效液相色谱也有很高的分离效能HPLC可分离分析高极性，高分子量和离子型的各种物质。

柱效很高每米可达3万块以上，一般用20 -- 25cm长的柱子，由于固定相的不断改进，最短的只有3cm ，理论板数可达3000—4000，能满足一般分析的需要，而且具有很高的分析速度柱子短，对压力要求就低过去高压，现在追求高精度，高稳定性，一般在室温下操作，样品不需预处理操作方便，容易掌握。

液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：(一) 应用范围不同液相色谱非常适合分子量较大，难气化；不易挥发或对热敏感的物质，离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70～80%。

(二) 流动相不同气相色谱的流动相载气是色谱惰性的永久性气体，不参与分配平衡过程,与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。

而在液相色谱中流动相是各种低沸点有机溶剂及水溶液。

也参与样品分子相互作用，因此液相色谱流动相的作用比气相色谱大，气相色谱的载气仅数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。

而液相色谱的流动相种类多，性质差别也大，对分离效果影响显著。

因对于LC来说，流动相的选择很重要，为提高选择性增加了一个因素。

液相色谱也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相,增大分离的选择性。

(三) 液相色谱分离类型多：如离子交换色谱和排阻色谱；液相色谱能完成难度较高的分离工作.就其分离机理的不同，高效液相色谱可分为液-固吸附色谱；液-液分配色谱；离子交换色谱和凝胶渗透色谱等多种类型。

液—固色谱的色谱柱内填充固体吸附剂，由于不同组分具有不同的吸附能力。

因此，流动相带着被测组分经过色谱柱时，各组分被分开液—液色谱的流动相和固定相都是液体。

作为固定相的液体涂在惰性担体上，流动相与固定液不互溶，当带有被测组分的流动相进入色谱柱时，组分在两相间很快达分配平衡，由于各组分在两相间分配系数不同而彼此分离。

以非极性溶液作流动相,极性物质作固定相的液—液色谱叫正相色谱；极性溶液作流动相，非极性物质作固定相的液—液色谱叫反相色谱。

离子交换色谱的色谱柱内填充离子交换树脂，依靠样品离子交换能力的差别实现分离。

而凝胶色谱是按试样中分子大小的不同来进行分离的。

在上述四类色谱中，应用最广泛的是液—液色谱。

液相色谱作为分析时选择余地大，而气相色谱达不到。

(四) 气相色谱一般都在较高的温度下进行分离分析，而液相色谱通常在室温条件下操作。

(五) 柱外效应：由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此,溶质在液相中的传质速率慢HPLC的柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。

(六) 制备：液相色谱不仅可用于分离分析，还可用于制备纯样品.液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。

回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备样品。

便于为红外，核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。

(七) 检测器等：液相色谱尚缺乏高灵敏度，通用型的检测器，液相色谱柱子昂贵；要消耗大量溶剂；液相色谱仪器比较复杂；操作严格；价格也较气相色谱仪昂贵；主是因为采用了高压泵在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。

高效液相色谱仪简介高效液相色谱仪包括以下主要部件：贮液罐→在线脱气装置→高压输液泵→进样装置→色谱柱→检测器→记录仪和数据处理装置。

1贮液罐贮液罐的材料应耐腐蚀，可为玻璃，不锈钢，氟塑料或特种塑料聚醚醚酮。

溶剂约为0.5一2.0L。

贮液罐放置位置要高于泵体，以便保持一定输液静压差。

使用过程贮液罐应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，还可以防止空气中02，CO2重新溶解于已脱气的流动相。

所有溶剂在放入贮液罐之前必须经过0.45pm滤膜过滤，除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进样阀产生阻塞现象。

2在线脱气装置流动相在使用前必须进行脱气，以除去其中溶解的气体，防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。

气泡的存在会增加基线噪音，严重时会造成分析灵敏度下降，而无法进行分析。

在线脱气装置把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。

3高压输液泵对高压输液泵的要求是：1.泵体材料能耐化学腐蚀；2.能在连续高压下操作；3输出流量范围宽、输出流量稳定、重复性高。

高压输液泵可分为恒流泵和恒压泵；目前在高效液相色谱中应用最广泛的也是最重要的输液泵是往复泵，往复泵属于恒流泵。

往复泵的优点是:1．可在高压下连续以恒定的流量输液；2.此泵的液缸容积很小只有几十至几百μl，其柱塞尺寸小易于密闭。

柱塞、单向阀和阀座造价低廉，更换溶剂方便，特别适用梯度洗脱。

4进样装置进样分为手动进样和自动进样两种。

手动进样使用的最多的是6通阀进样装置。

先将进样阀置于“取样“位置，用特制的平头注射器将样品注入定量环中，再将进样阀至于“进样“位置，流动相将样品携带进入色谱柱。

此种进样重现性好，能耐20Mpa的高压。

自动进样器是由计算机自动控制定量阀，按照预先编制注射样品的操作程序工作。

取样、进样、复位、样品管路清洗和样品盘的转动，全部按照预定程序自动进行，一次可以进行几十个甚至上百个样品的分析。

自动进样器的样品量可连续调节，进样重复性高，适合做大量样品分析，节省人力，可实现自动化操作。