学校代码：11059学号：0802012040Hefei University本科毕业论文BACH ELO R DI SSERTATIO N论文题目：藻类保健品中藻蓝蛋白的盐析提取技术研究学位类别：工学学士学科专业：生物工程作者姓名：导师姓名：夏潇潇完成时间：二零一二年五月目录摘要 (Ⅰ)Abstract (Ⅱ)1 引言 (1)1.1 螺旋藻的简介 (1)1.2 藻蓝蛋白介绍 (2)1.3 藻蓝蛋白的提取方法 (2)1.4 研究的意义、目的和内容 (3)1.4.1 研究的意义 (3)1.4.2 研究的目的 (3)1.4.3 研究的内容 (3)2 材料与方法 (4)2.1 原料和仪器 (4)2.1.1 原料 (4)2.1.2 主要仪器 (4)2.1.3 主要试剂 (4)2.2 实验方法 (5)2.2.1 原料中总蛋白质含量的测定 (5)2.2.2 螺旋藻的前处理及藻蓝蛋白计算 (5)2.2.3不同盐的提取实验 (6)2.2.4 冻融次数实验 (6)2.2.5 盐浓度实验 (6)2.2.6 提取次数实验 (7)3 结果与分析 (8)3.1 原料中总蛋白质含量结果与分析 (8)3.2 不同盐的提取实验结果与分析 (8)3.3 盐浓度实验结果与分析 (9)3.4 冻融次数实验结果与分析 (13)3.5 提取次数实验结果与分析 (18)3.6 总结 (22)5 结论 (23)参考文献 (24)致谢 (26)摘要本文对螺旋藻精片中藻蓝蛋白的提取工艺进行研究，考察不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。
可知：针对不同盐的最佳提取条件分别为：氯化钠：浓度30%，冻融次数6次，提取次数3次；磷酸钾：浓度50%，冻融次数6次，提取次数4次；硫酸铵：浓度40%，冻融次数6次，提取次数6次；硝酸钾：浓度40%，冻融次数8次，提取次数6次。
在最优提取条件下，氯化钠、磷酸钾、硫酸铵和硝酸钾的提取率分别为11.00%、10.87%、11.767%和10.837%，其中硫酸铵的提取率最高，可将约98%的藻蓝蛋白提取出来。
关键词：藻蓝蛋白；盐析；冻融；提取；得率Abstractthis article research about the extraction process of Spirulina film and the extraction rate of different salts, different concentration, freezing and thawing times, the number of extraction; I Against the best Extracting conditions, respectively ①Sodium chloride: 30% concentration, freezing and thawing 6 times, three times the number of extraction; ②Potassium phosphate: 50% concentration, freezing and thawing 6 times, and extracted 4 times; ③Ammonium sulfate: 40% concentration, freezing and thawing 6 times, six times the number of extraction;④Potassium nitrate: 40% concentration, freezing and thawing times eight times, six times the number of extraction. Under the best extracting condition, the extraction rate of Sodium chloride; Potassium phosphate; Ammonium sulfate; Potassium nitrate are 11.00%.10.87%.11.767% and 10.837%,respectively.Ammonium ,sulfate can be extracted. The extraction rate about 98% of the phycocyanin .Key words：phycocyanin; salting; freezing and thawing; extraction; yield1 引言1.1 螺旋藻的简介螺旋藻（如图1），是存在于地球已逾30亿年的低等水生藻类植物，属于蓝藻门，颤藻科。
它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。
蓝藻的细胞结构原始，且非常简单，是地球上最早出现的光合生物，其外观为蓝绿色，显微镜观察呈螺旋状，故而得其名[1]。
在非洲的乍得湖和墨西哥的Texcoco湖畔（图2），当地居民用螺旋藻作为食物来源已有一百年的历史。
螺旋藻因其丰富、优质的蛋白质而被联合国粮农组织和世界食品协会誉为“人类最理想和最优秀的食品”；国际儿童基金会则称“螺旋藻可以安全根除儿童营养不良”；Clement博士称其为大自然为人类早就准备好的一份“超级营养包”、“微型的营养宝库”；1973年第二届国际微生物蛋白质会议确认“螺旋藻是最佳蛋白质来源之一”、“螺旋藻是人类迄今为止所发现的最优秀的纯天然保健食品源”[2]。
图1显微镜下的螺旋藻图2螺旋藻的生长地螺旋藻主要以干粉形式直接应用食品行业，其蛋白质含量为56%~77%；总脂肪含量约7%，脂肪酸为5.7%，并且其中大多为多不饱和脂肪酸，亚油酸、γ-亚麻酸，螺旋藻中碳水化合物的含量为16.5%,并含有丰富的多糖[2]；维生素B1.55mg/kg、维生素B2.40mg/kg、维生素B6.3mg/kg、维生素B12.2mg/kg、泛酸11mg/kg、叶酸0.5mg/kg、烟酸113mg/kg、肌醇350mg/kg、生物素0.4mg/kg、维生素E190mg/kg、胡萝卜素4000mg/kg [3-7]。
螺旋藻是超碱性食品，可维持血液中酸碱值的平衡，降低胆固醇，减轻高血压和心脏病症状或减少其发病几率；有效改善胃病症状，对抗各种腹泻和便秘，防治贫血，帮助脂肪代谢，有效对抗心脑血管疾病，预防脂肪肝和肝硬化，降低血糖，预防糖尿病；预防因服用镇定剂、抗生素、抗癌剂等对肾机能的损害；减轻汞及药物对肾的毒性，使人体免受重金属的毒害；减肥，美容，去暗疮、黄褐斑，抗衰老。
螺旋藻中尤以蛋白质含量最为丰富，是大豆蛋白质的两倍，是目前已知植物中蛋白质含量最高的一种[4-6]。
1.2 藻蓝蛋白的介绍螺旋藻中的蛋白质被称为藻蓝蛋白体，它由多种藻蓝蛋白及连接蛋白或多肽组成，藻蓝蛋白是强荧光的色素-蛋白络合物，能捕获光能。
根据他们存在的不同发色团又把藻蓝蛋白分为三大类[11]：藻红蛋白(吸光度480~570nm)、藻蓝蛋白(吸光度590~630nm)、藻红蓝蛋白(吸光度560~600nm)和别藻蓝蛋白(吸光度620~665nm)。
其中藻蓝蛋白占总藻蓝蛋白中的20%左右。
藻蓝蛋白包含了一个蛋白和一个发色团，而蛋白是由分子量分别在18Ku和20Ku的α和β亚基组成。
藻蓝蛋白是一种重要的藻蓝蛋白，参与藻类高效的光传递过程，分离纯化藻蓝蛋白对于研究其结构以及模拟其生理功能有重要意义，作为一种荧光物质，藻蓝蛋白在生物标记等方面也有广阔的应用前景[12]。
1.3藻蓝蛋白的提取方法螺旋藻受其细胞壁的保护，采用机械方法很难达到破壁效果，所以目前提取藻蓝蛋白的方法通常有采用化学破壁法、溶胀法和反复冻融法等[13-16]。
①化学破壁法：是用化学缓冲液破坏细胞壁后提取藻蓝蛋白的方法。
虽然它可有效破壁，但也给下一步分离造成了很大麻烦，需要花费较多的工序，使运行成本大幅上升。
②溶胀法：是利用原料溶解，在一定条件下膨胀的性质进行破碎的方法。
该种方法需要的实验周期较长，实验条件要求高。
③超声法：是利用超声波粉碎技术控制仪器的频率、能量和波发射间歇周期，经过一定时间来使细胞破碎。
该方法操作简单，易控制，但单一使用此方法，必须使用高能量、低频率的超声仪才能达到理想的细胞破碎率，这会增加成本。
④反复冻融法：是将含有水分的螺旋藻置于0℃以下冻结成冰，然后取出在0℃以上解冻，利用水在-20℃﹣27℃的膨胀特性，破壁析出藻蓝蛋白。
这种技术完全采用了物理方法将螺旋藻的细胞壁破裂，不使用任何化学添加剂，同时耗费的能源很少，因此方法很简单，容易实施，保全了螺旋藻的固有成分，藻蓝蛋白的生物活性不受破坏。
此方法所需要的设备简单，整个破壁工序需要的时间短，可大大提高生产效率，降低成本。
蛋白质的提取多用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硝酸钾、氯化钠、磷酸钾等。
其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来。
1.4 研究的意义、目的和内容1.4.1 研究的意义藻蛋白是当前研究的热点，如何提高螺旋藻蛋白的提取率是拓宽螺旋藻应用的一个关键。
本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，实现更快速更高效的藻蓝蛋白提取率，为螺旋藻蛋白质的充分利用提供研究基础。
1.4.2 研究的目的本文以反复冻融法破碎螺旋藻细胞，辅以超声提取技术，考察不同提取条件对藻蓝蛋白提取率的影响，确定最佳的提取条件，建立藻蓝蛋白盐析提取工艺路线。
1.4.3 研究的内容（1）原料中总蛋白质含量的测定。
（2）不同盐、不同浓度、冻融次数、提取次数对藻蓝蛋白提取率的影响。
2 材料和方法2.1 材料与方法2.1.1 原料原料名称生产厂家产品批号螺旋藻精片云南白药-千草堂Q/YBZ 0002S-2011 2.1.2 主要仪器仪器名称生产厂家KDC160HR型高速冷冻离心机上海博讯实业有限公司医疗设备厂HF-2.5B脉冲超声循环提取机北京弘祥隆生物技术开发有限公司ATN-300型全自动凯氏定氮仪上海洪纪仪器设备有限公司电子天平德国赛多利斯股份有限公司752分光光度计合肥正鑫仪器设备有限公司福意联电冰箱北京福意电器有限责任公司HH型恒温水浴锅巩义市科瑞有限公司2.1.3 主要试剂主要试剂生产厂家硫酸铵国药集团化学试剂有限公司磷酸钾盐国药集团化学试剂有限公司浓硫酸国药集团化学试剂有限公司硫酸铜国药集团化学试剂有限公司氯化钠国药集团化学试剂有限公司硝酸钾国药集团化学试剂有限公司2.2实验方法2.2.1原料中总蛋白质含量的测定实验采用的为凯氏定氮法。
主要分为两个部分组成：(1) 消化：称取0.2g 样品粉末，精确至0.001g ，移入干燥的25mL 定氮瓶中，加入0.2g 硫酸铜、6g 硫酸钾，再加入20mL 浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上，在温度约100℃小心预热2h ，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，升高温度至350℃，并保持瓶内溶液微沸状态，待溶液由黑色变为棕黄色，再变为蓝绿色并澄清后，再继续加热1h 。