螺旋藻粉提取藻蓝蛋白
摘要：藻蓝蛋白是一种可用于配制化妆品及各种天然食品或荧光探针标记的多用途蛋白。
本实验旨在找出最适螺旋藻粉中提取藻蓝蛋白的工业提取工艺。
对藻蓝蛋白的提取，本课题组采用了反复冻融法、水提法、缓冲液法，以找出提取效率高，成本低的方法。
实验结果显示，反复冻融三次的藻蓝蛋白浓度A620/A280分别为：0.819/1.871、0.597/1.676、0.245/0.629;水提法三次的A620/280分别为：
0.842/1.768、0.650/1.136、0.177/0.737;缓冲液提取三次的A620/A280分别为：
1.040/
2.102、0.260/0.630、0.052/0.247。
在蛋白质的分离时，采用两步盐析法，盐析前A620=1.143，A280=1.983；两步盐析后，A620=2.203，A280=1.492。
最后在纯化方法上选择了羟基磷灰石柱分离，得到蛋白样品A620=1.379，A280=0.528。
关键词：螺旋藻；藻蓝蛋白；二次盐析；柱分离
介绍：藻蓝蛋白既是一种蛋白质，又是一种很好的天然食用色素，同时又是极好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。
21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。
因为藻蓝蛋白为胞内蛋白，所以细胞破碎技术是直接影响蛋白提取得率的关键因素之一。
藻蓝蛋白的提取一般有超声波、高压均质、反复冻融、水提法、缓冲液提法等【1】。
本实验通过反复冻融、水提法和缓冲液法对螺旋藻细胞进行破碎提取藻蓝蛋白，对各条件下得到的蛋白溶出率进行了比较分析，确定了各条件下蛋白提取的最佳条件。
在藻蓝蛋白的分离时，主要是把蛋白质与提取液中其他物质分离。
可利用蛋白质的盐析【2】，和调节PH使蛋白变性等，使蛋白质从提取液中分离出来；最后，再把藻蓝蛋白从杂蛋白中分离出来，常用的方法有柱分离法等【3】。
1 藻蓝蛋白的提取
1.1 反复冻融法
本实验首先采用的是反复冻融法。
取60g螺旋藻藻粉溶于1200ml蒸馏水中，在-20℃冰箱中反复冻融三次，每次取10000r/min离心上清液。
将上清液稀释20倍后，利用藻蓝蛋白在620nm紫外光下有特殊吸收峰，测定其在280nm和620nm 下的吸收值，以测定藻蓝蛋白的浓度。
表1 冻融法提取效果
提取次数A620nm A280nm A620/A280 体积ml
1 0.819 1.871 0.438 1100
2 0.597 1.676 0.356 350
3 0.245 0.629 0.389 350
1.2 水提法
将20g螺旋藻藻粉溶于400ml蒸馏水中，在搅拌转子搅拌4h，10000r/min 离心10min，取上清液。
将沉淀溶于400ml蒸馏水后继续搅拌4h后再次10000r/min 离心10min，取上清液。
再将沉淀溶解于400ml蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液。
将三次的上清液分别稀释20倍后测定在280nm和620nm下的吸光值。
表2 水提法提取效果
提取次数A620nm A280nm A620/A280 体积ml
1 0.84
2 1.768 0.476 350
2 0.650 1.136 0.572 200
3 0.177 0.737 0.240 200
1.3 缓冲液提法
将20g螺旋藻藻粉溶于400mlPBS缓冲液中，在搅拌转子搅拌4h，10000r/min离心10min，取上清液。
将沉淀溶于400ml蒸馏水后继续搅拌4h后再次10000r/min离心10min，取上清液。
再将沉淀溶解于400ml蒸馏水进行第三次搅拌，离心后取上清液。
将三次的上清液分别稀释20倍后测定在280nm和620nm下的吸光值。
表3 缓冲液提取效果
提取次数A620nm A280nm A620/A280 体积ml
1 1.040 2.10
2 0.495 350
2 0.260 0.630 0.41
3 200
3 0.052 0.247 0.211 200
2 藻蓝蛋白的分离
不同饱和度的硫酸铵对螺旋藻藻蓝蛋白盐析的影响由表4可知，当硫酸铵饱和度为20％时，上清液在620 nm处的吸收峰值高同时在280nm处吸收峰值很低，说明杂蛋白较多的沉淀而藻蓝蛋白没有沉淀；饱和度为40%时，上清液在620nm 处吸收值最低，同时在280nm处吸收值很高，也就是藻蓝蛋白的提取量大且杂蛋白含量低，比活力的值也最大，藻蓝蛋白的提取纯度也是最大的。
所以本实验采用先20％饱和度的硫酸铵进行盐析，10000r/min离心后取上清液后，再用40%饱和度的硫酸铵进行盐析，10000r/min离心后取沉淀。
表4 不同饱和度的硫酸铵对螺旋藻藻蓝蛋白盐析的影响
硫酸铵浓度上清液A620 上清液A280 沉淀A620 沉淀A280
10%硫酸铵0.557 0.965 0.021 0.113
20%硫酸铵0.398 0.862 0.158 0.195
30%硫酸铵0.030 0.635 0.443 0.389
40%硫酸铵0.002 0.519 0.483 0.504
50%硫酸铵0.002 0.447 0.488 0.559
60%硫酸铵0.001 0.381 0.433 0.541 经过20%硫酸铵和40%硫酸铵两步盐析后，所得蛋白的A620=2.203，A280=1.442。
3. 藻蓝蛋白的纯化
3.1 羟基磷灰石的制备
称取羟基磷灰石10g，加入蒸馏水搅拌过夜。
将羟基磷灰石悬浊液迅速上柱，待羟基磷灰石压实后加入样品。
3.2藻蓝蛋白的纯化
将藻蓝蛋白粗品液分别通过10 mmol/L的PBS预平衡了的羟基磷灰石吸附上柱。
然后在洗脱过程中不断增加PBS离子强度(分别以10、20、50、100、200 mmol/L、pH=7.0的PBS缓冲液，分别收集不同离子强度缓冲液的洗脱液，并进行吸收值测定。
经过测定，过柱后的藻蓝蛋白的A620=1.379，A280=0.528，A620/A280=2.612。
4 结果
将三种提取方法从提取率，提取时间，设备需求，辅料用料及价格等多个方面进行比较【4】，结果显示：缓冲液第一次提取浓度最高A620=1.040，水提法其次A620=0.842，冻融法最差A620=0.819；第二次提取浓度水提法最高A620=0.650，冻融法其次A620=0.597，缓冲液最差A620=0.260；第三次提取，三种方法的提取浓度都很低，不利于工业生产。
淘汰提取效率低的冻融法，又由于缓冲液成本高于水，且水提法的提取浓度已经较高，所以最适合的工业提取法为二次水提法。
将水提法所得的藻蓝蛋白的粗提液用20%硫酸铵盐析，使杂蛋白尽可能沉淀，藻蓝蛋白尽量多地保存在上清液中；10000r/min离心10min后，取上清液，然后用40%的硫酸铵进行二次盐析，将藻蓝蛋白尽可能多地沉淀，杂蛋白保留在上清液中。
所得蛋白的A620=2.203，A280=1.442，A620/A280=1.528。
最后经过羟基磷灰石柱后，藻蓝蛋白进一步纯化，其A620=1.379，A280=0.528，A620/A280=2.612。
参考文献
[1] 刘立闯，胡志和，刘彤，贾静.螺旋藻蛋白提取方法比较研究[J].食品科学，2008，Vol. 29, No.11.
[2] 朱丽萍，颜世敢，李雁冰.硫酸铵盐析条件对多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白得率和纯
度的影响[J].科技导报，2010,28（4）.
[3] 韦萍,李环,张成武.极大螺旋藻藻蓝蛋白的提取与纯化[J].南京化工大学学报，1999， Vol.21,No.3.
[4] 胡一兵,胡鸿钧,李夜光,耿亚红.从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝
蛋白的研究[J].J ourna l of Wuhan B otan ica l Resea rch,2002, 20 (4) : 299～302.。