溶液稀释与配比C1V1=C2V2：万能稀释公式，一般母液和终浓度比不为X:1用这个公式计算。

X/1：当母液与终浓度比为X：1时用这个快速方法，此时方法为把母液分为1，剩下的用总比例减掉，如：X2（1:1），X6（1:5），X10（1:9）。

百分数和mol数转以1%盐浓度进行转换换设是100克的此溶液，则有99克的水和1克的盐（NaCl），盐的物质的量为1/58.5=0.017mol，水体积为99mL=0.099L，所以物质的量浓度为0.017/0.099=0.17mol/L，即摩尔浓度为0.17mol/L1%=1g/100g (1/58.5)/0.099CTAB法提取DNA1.各成分作用CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；Tris-HCl (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

2.操作步骤打样新鲜叶片，转速220r/min，1min，打样时管身全部冻着，而且放在打样机的时候保证盒子里面得有液氮，这样样品才能充分打碎，写字的朝向一致，以便认字提取1)称取0.1g(约3-4片)新鲜叶片，液氮中研磨成粉末，加入800ulCTAB缓冲液轻轻摇匀，65°C水浴（烘箱）保温30min左右；备注用2ml管提取时，加完CTAB在本子上记录好每个样品的名字，防止后面漏管和裂管时查找被抹掉的号，这样可以防止在侧壁写管的麻烦；在等待的过程时，即可拿出1.5ml离心管加入异戊醇做好准备；写字的朝向一致，以便认字2)冷却（放冰箱）至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）盖上瓶盖，温和摇动，使成乳状液。

备注一定要冷却，不然的话，热涨后盖子盖不紧，此处必须摇匀，不然会因为分层不明显，表面容易起一层油状层；3)（按照管盖的的朝向，在加完异戊醇的管上写上对应样品名字，字迹要大，以防相同的数字出现如81/18，以及即使掉了一些也还有一部分可以识别）4)8000rpm 10min ,离心管中出现三层，小心吸取含有DNA的上清液（400-500ul）到新的1.5ml离心管中。

根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇重复抽提1-2次；备注吸上清液时，按照前面写好的顺序，打开盖，同时打开异丙醇的盖，可以检查哪些漏掉，一旦发现漏掉的，立马盖上盖子，吸完别的后平躺着吸这管吸上清时，枪头不要挨着最深处的上清液，挨着上面那个片层处吸，能吸多少吸多少5)在上清液中，加入0.7倍/等体积的异丙醇（400-500ul），颠倒混匀，放-20入冰箱不少于20min；备注：倒废液时，用空板一排一排倒6)8000rpm 离心10min，弃上清；加600ul的70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，8000rpm 离心5min，除去乙醇，即为DNA粗制品；备注：倒扣在卫生纸上，可以干得更快，40min左右即可拿出，迅速加水溶解，37摇床,67r，1h3.注意事项1)吸取上清液时一定要小心，必要时减掉枪头顶端；2)在倒废液时，找一个管架，盖子打开后朝里侧将其尽量合拢，管口朝外，扣住管架后，一起倒掉废液，这样可以避免液体毁掉管上的字；3)在盖盖时，拇指按住盖，找准方向按下去；碱煮法提DNA试剂0.1moL/L NaOH：4g NaOH，定容至1L1×TE（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0）组分1 M Tris-HCl （pH 8.0）1 ml0.5 M EDTA （pH 8.0）0.2 ml超纯水至100 ml1)1 M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml的配制：称取Tris碱6.06 g，加超纯水40 ml溶解，滴加浓HCl约2 ml调pH至8.0，定容至50 ml。

2)0.5 M EDTA（pH 8.0）50 ml的配制：称取EDTA-Na2·2H2O,9.306 g，加超纯水35 ml，剧烈搅拌，用约1.2g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50 ml。

（EDTA 二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时，才会溶解。

）步骤1.向装有样品的96孔PCR板中，每孔加100μＬ的0.1moL/L NaOH，盖紧配套的硅胶盖，放入PCR仪中，99.9℃加热10min（此步也可在沸水中水浴）。

2.冷却到室温后，快速离心，然后每孔加入100μＬ的1XTE（PH=2.0），盖紧硅胶盖充分混匀并快速离心，上清液即可直接用做ＰＣＲ反应的模板。

RNA提取1磨样（1）编号（冻前写）如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。

（2）磨样（冻钵，持低温，快，细）一定要使材料处于低温状态。

研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！否则会RNA降解得很厉害。

研得细和研得很细，提出的RNA量可以相差几倍！所以，在液氮保护的很好的情况下多研磨几次，要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来！（3）装管（冻管，液装，晚盖）材料一定要有液氮的保护才行。

可以这样做：1、将几个离心管放入一个容器，向容器中加液氮，将其冷冻一下，使之处于低温状态，2、将液氮还未挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。

将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。

PCR扩增1.序列分析1、首先将模板序列在NCBI上做BLAST分析，避开序列的保守位点。

如下图2、如果序列的片段过长，则分段设计引物进行扩增。

因为片段过长会导致中间某些地方扩增不出来，从而导致整个序列扩增不出来。

3、二级结构的分析，有的材料扩不出来需要考虑是否存在2级结构，反向重复，高GC，Poly结构。

这时需要分段设计引物进行扩增与测序。

2.PCR引物设计原则引物设计位置（扩出来）如果是做反向遗传学的话，引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

在做基因组扩增的时候，保证引物特异性的前提下，引物设计的位置最好是在外显子上，因为参考基因组所给的序列只是一个参考，在CDS区域上物种与物种，物种内的都具有较高的保守性，在启动子区域不同的材料之间存在较多的多态性位点。

为了保证引物的有效性，最好是在外显子上设计引物。

引物特异性（扩单一）当引物与所扩片段的其他序列进行错误匹配时，可以导致杂带和目的条带扩增不出来。

另外引物与基因组其他序列进行匹配上也可以导致此问题，这就需要引物设计完成以后，对其进行BLAST检测。

如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

因此在进行引物设计前一定要注意序列的分析。

引物GC含量GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应，GC含量在50%左右比较合适，而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%，另外上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（melting temperature，寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度），相差不能太大，一般在3℃。

若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm范围为56-63℃（其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳？）。

Tm过高：引物结合不上去，扩不带，太低引物特异性不好。

引物3′端引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5′末端和相对稳定性较弱的3′，末端如果引物3′稳定性强有可能在即使5′末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩增条带secondary bands 而3′末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸要避开密码子的第3位，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

引物的5′端引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5′末端，这一段有较强稳定性的5′末端称为GC钳，它保证引物与模板的稳定结合。

另外5′末端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能。

形成双链结构并引发DNA 聚合反应。

（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）引物互补性Hairpin单个引物因为有回文结构会形成十字形结构Dimer单个引物，引物之间可形成局部互补双链5’-ATTTCTTACTGGAG-3’3’-GAGGTCATTCTTTA-5’False priming引物与该条序列上其他位置（或者基因组其他位置）进行错配结合，可以通过序列分析之后进行规避Cross Dimer两条引物之间互配，形成局部双链引物自身不能有连续4个或者分布有较多的互补碱基，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。