蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸 残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成 带负电荷或正电荷的基团。
蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数 目以及溶液的pH。
2. 等电点：使蛋白质分子所带的正电荷与负电荷
恰好相等，净电荷为零的溶液pH。（与AA相同）
每种蛋白质都有特定的等电点，这是鉴别蛋白质的指标之一。 等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。
根据蛋白质分子结构的特点，适当改变上述 外界因素，就可以选择性的控制蛋白质混合物 中某一成分的溶解度，作为分离纯化蛋白质的 一种手段。
1. 等电点沉淀和pH控制
利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白 质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯 化的方法称为等电点沉淀法。
在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除 了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质 仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法 经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。
应用:
(1)蛋白质分离纯化 (2)解毒 (3)临床检验
引起蛋白质沉淀的原因
1、加入脱水剂以除去它的水化层。 2、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失
去携带相同净电荷。 3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝
集成大的质点而沉淀。
水化层
蛋 白 质
+++
酸
碱
－－
－
－
胶
+
+碱
体
++
酸
－ －－
－
1 . 电泳
电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的
蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以 分开。
F=Ff
qE=fV
泳动度 µ=v/E
电泳的发展
a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进 行电泳。
b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲 液的支持物上进行电泳，不同组分形成 带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖 、聚丙烯酰胺）作支持物。
溶 液
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
带负电荷的蛋白质
沉 淀 脱水作用
脱水作用
脱水作用
作 用 示
++ +
+
碱
+
意
+
图
++
－－
酸－
－
－
－－ －
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
蛋白质的聚沉
使蛋白质沉淀的方法
(1) 盐析法( salting out)
——向蛋白质溶液中加入大量中性盐 使蛋白质沉淀称为盐析。 •常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、 氯化钠等
（1） PAGE： PAGE电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳 凝胶板分为两部分：
PAGE
浓缩胶
垂 直
平
板
电
分离胶
泳 示
意
图
PAGE的三种分离效应
分子筛效应 电荷效应 浓缩效应
•高效的分辨率
（2）等电点聚焦
蛋白质是两性电解质
当pH=pI时净电荷为零，在电场中既 不向正极也不向负极移动，此时的 pH就是该蛋白质的等电点(pI)
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完
全，最迅速。 原理：
1、蛋白质天然结构解体，疏水基外露， 破坏了蛋白质的水化层 2、破坏电荷情况
三 蛋白质分离纯化的一般原则
（一） 纯化的目标 （二） 蛋白质分离纯化的一般原
则
（一）目标
蛋白质在生物体中一般都是以复杂的混合物形 式存在，在实际工作中，要研究或应用某种蛋 白质，必须将其分离提纯到一定的水平。
卵清蛋白晶体
3. 有机溶剂分级法
与水互溶的有机溶剂（如乙醇和丙酮）能使蛋白 质在水中的溶解度显著降低， 原因之一是降低了介质的介电常数，蛋白质表 面的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进 了蛋白质分子的聚集沉淀； 原因之二与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺 水化水，致使蛋白质聚集沉淀。
有机溶剂分级分离原理示意图
原理:
以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性 电解质载体，在电场作用下，两性电解质 载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质 在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动 而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电 聚焦电泳(isoelectric focusing-PAGE， IEF-PAGE)
4 温度对溶解度的影响
在低离子强度时，蛋白质的溶解度大多数在一 定范围（约0-40℃）内是随着温度增加而增加 的。
但在40-50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定 并开始变性，一般在中性介质中就会失去溶解 力。
大多数蛋白质在低温下比较稳定。因此，蛋白 质的分级分离操作一般都要求在低温下进行。
（三）根据电荷不同的分离方法
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通 过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质 的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
（二）根据溶解度差别纯化的方法
影响蛋白质溶解度的外界因素主要有： （1）溶液的pH， （2）离子强度[I]， （3）介电常数ɛ， （4）温度T。
第五章 蛋白质的通性、纯化和表征
≤目的要求≥
1、掌握蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。 2、熟悉蛋白质分离纯化的一般原则，掌握蛋白
质分离纯化方法。 3、掌握蛋白质的含量测定与纯度鉴定。
≤重点难点≥
1、蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。 2、蛋白质的分离纯化方法。
一、蛋白质的酸碱性质
1. 蛋白质分子的可解离基团
•作用原理: 盐离子与水的亲和力极强，可脱去蛋白
分子表面的水化层；盐离子中和蛋白分 子表面的电荷，最终蛋白质聚集沉淀。
•特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。
(2) 有机溶剂沉淀法
• 原理:
使蛋白质脱去水化层，又能降低溶液的介电常 数，增强异性电荷间的相互作用而使蛋白质分 子聚集沉淀。 •常用有机溶剂: 甲醇、乙醇、丙酮
交联葡聚糖凝胶 Sephadex
琼脂糖凝胶 Sepharose
聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-gel P）
以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰 胺（单体）聚合而成
(2)凝胶过滤的原理
凝胶过滤的原理：
当含有各种组分的样品 流经凝胶层析柱时，大分子 物质由于分子直径大，不易 进入凝胶颗粒的微孔，沿凝 胶颗粒的间隙以较快的速度 流过凝胶柱。而小分子物质 能够进入凝胶颗粒的微孔中， 向下移动的速度较慢，从而 使样品中各组分按相对分子 质量从大到小的顺序先后流 出层析柱，而达到分离的目 的。
蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:
3. 等离子点
蛋白质的等电点在有中性盐（Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42-）存在下可 以发生明显的变化。
等离子点：蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中， 蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受 体基团结合的质子数相等时的溶液的pH值。
等离子点是一个特征常数
常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex） 是由线型的α-1,6-葡萄糖与1-氯-2,3-环氧丙 烷反应而成,商品名为Sephadex 。
聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP) 是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共 聚而成，商品名为Bio-Gel P。
琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-gel A) 是从琼脂中分离制得的，商品名为Sepharose 或Bio-Gel A
单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距 较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要 一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。
2. 盐溶和盐析
盐溶(salting in) 是指低浓度的中性盐 可以增加蛋白质溶解度的现象。
盐析(salting out) 是指当中性盐的离子 强度增加到足够高时，（如饱和或半饱 和的程度），很多蛋白质可以从水溶液 中沉淀出来的现象。 常用盐析盐类： (NH4)2SO4 ，NaCl等
透析与超过滤简易装置
超滤装置
2 凝胶过滤
（1）凝胶过滤的介质
凝胶的网孔大小决定分离范围
能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分 子质量范围
Sephadex G-50 1 500~30 000 有时用排阻极限来表示分离范围的上限,排阻极 限指不能扩散进入凝胶网孔的最小相对分子量, 如Sephadex G-50的极限为30 000
盐溶原理示意图
盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子 后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质 分子与水分子之间的相互作用却加强。
盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐 使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水 转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极 性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白 质分子表面的水化层。
（一）根据分子大小不同的纯化方法 1 透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration) 2 凝胶过滤(gel filtration)
1 透析和超滤
* 透析(dialysis)
利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋 白质大分子与其他小分子物质分开的方法。
* 超滤法
应用正压或离心力，使水和其他小分子通过半透 膜而蛋白质被截留在膜上，达到浓缩或脱盐\粗 分级的目的。
盐析原理示意图
应用
盐析是一种最常用的分级分离的方法之一,利用好 了一步即能去大量的杂蛋白。 现在已有的很多蛋白水解酶或其酶原都已经利用 盐析进行了沉淀并结晶,如:胰凝乳蛋白酶原,胰蛋 白酶等。 优点:保持蛋白质的天然构象,能再溶解